ピリミジン類似体である5-ヨード-2'-デオキシウリジン(IdU)と細胞周期マーカーを使用して、マスサイトメトリープラットフォームで細胞周期相を確立します(英語)

質量サイトメトリーは、質量分析法の高分解能と定量性を利用して、約40のパラメータの検出を可能にします。蛍光色素標識抗体の代わりに金属標識抗体が使用され、より多くのチャネルが可能で、スピルオーバーが最小限に抑えられます^1,2。MCMには、フローサイトメトリーと比較して、細胞周期解析に関して長所と短所があります。MCMの主な利点の1つは、多数のパラメータにより、非常に不均一なサンプル中の多数の免疫表現型的に異なるT細胞タイプにわたる細胞周期状態を同時に測定できることです。MCMは、ヒト骨髄³およびテロメラーゼ欠損症⁴のトランスジェニックマウスモデルにおける正常造血中の細胞周期状態の測定に成功しています。急性骨髄性白血病(AML)における細胞周期状態の解析は、細胞周期が臨床療法に対する既知の反応と相関していることを示し、治療の選択に情報を提供できる機能的特徴へのin vivoの洞察を提供します⁵。マスサイトメトリー細胞周期分析の第2の利点は、細胞周期状態と相関し得る多数の他の機能マーカーを測定する能力である。最近の研究では、IdUとBRUおよびrRNA⁶に対する金属タグ付き抗体を使用することにより、タンパク質およびRNA合成を細胞周期状態と相関させることができました。分化の連続体における多数の集団にわたる細胞周期状態を測定するこの種の高度にパラメトリックな分析は、現在のフローサイトメトリー技術ではほぼ不可能です。MCMの主な欠点は、蛍光フローサイトメトリーで使用されるもの(DAPI、ヘキスト、ピロニンYなど)と同等のDNAまたはRNA染色がないことです。蛍光色素はDNAおよびRNA含量の比較的正確な測定を与えることができるが、この精度はヌクレオチド塩基間のインターカレーション時に生じるこれらの色素の蛍光特性の変化によってのみ可能である。したがって、MCM分析では、DNAまたはRNA含有量を同様の精度で測定することはできません。代わりに、マスサイトメトリー細胞周期分析は、サイクリンB1、リン酸化網膜芽細胞腫タンパク質(pRb)、リン酸化ヒストンH3(pHH3)などの細胞周期状態に関連するタンパク質の測定と、S期細胞へのIdU取り込みからのヨウ素原子の直接測定に依存しています。これら2つの測定アプローチは、正常な細胞増殖中に非常に類似した結果をもたらしますが、細胞周期の進行が破壊されると、潜在的に不一致になる可能性があります。

各細胞周期期の細胞数の測定は、正常な細胞周期の発達や、がんや免疫疾患でよく見られる細胞周期の破壊を理解する上で重要です。MCMは、金属タグ付き抗体を使用して細胞外および細胞内因子の信頼性の高い測定を提供します。しかし、イリジウムベースのDNAインターカレーターは2Nと4NのDNAを区別できなかったため、S相の測定は制限されていました。細胞周期の段階を定義するために、Behbehaniは、質量サイトメーターの範囲内に収まり、S期³の細胞を直接測定できる質量127のIdUを利用する方法を開発しました。この直接測定により、二次抗体の必要性や、酸やDNaseなどのDNA変性剤の使用を回避できます。細胞内サイクリングマーカーと組み合わせることで、実験モデルにおける細胞周期分布の高分解能を可能にします。

このプロトコルは、MCMの一般的なフローサイトメトリープロトコルからの細胞周期測定を適応させます。私たちの方法は、細胞周期パラメータを含めるための便利で簡単な方法を提供します。in vitroサンプルのIdU取り込みは、37°Cで10〜15分のインキュベーションしか必要とせず、数時間のインキュベーション時間を推奨するほとんどのBrdU染色プロトコルよりも短い^3,7。IdUおよびBrdUに組み込まれたサンプルは、プロテオミクス安定剤を使用して固定し、-80°Cの冷凍庫にしばらく保存できます。これにより、サンプルの品質を低下させることなく、バッチ分析のために多数のIdU染色サンプルをアーカイブすることができます。