Purificación de Prominin-1+ Células Madre del Cerebelo de Ratón Postnatal
Summary
Aquí se muestra un método eficiente y rentable para purificar, cultivar y diferenciar las células madre de la materia blanca del cerebelo del ratón postnatal.
Abstract
La mayoría de las neuronas cerebelosas surgen de dos nichos de tallo embrionario: un nicho de labio rombio, que genera todas las neuronas glutamatérgicas excitatorias cerebelosas, y un nicho de zona ventricular, que genera las células purines gecolégicas inhibitorias, que son neuronas que constituyen los núcleos cerebelosares profundos y Bergman glia. Recientemente, se ha descrito un tercer nicho de células madre que surge como una zona germinal secundaria del nicho de la zona ventricular. Las células de este nicho se definen por el marcador de superficie celular prominina-1 y se localizan a la materia blanca en desarrollo del cerebelo postnatal. Este nicho representa la capa molecular de nacimiento tardío interneuronas GABAérgicas junto con astrocitos cerebelos generados posnatalmente. Además de su papel de desarrollo, este nicho está ganando importancia traslacional en cuanto a su participación en la neurodegeneración y la tumorigenesis. La biología de estas células ha sido difícil de descifrar debido a la falta de técnicas eficientes para su purificación. Aquí se muestran métodos eficientes para purificar, cultivar y diferenciar estas células madre cerebelosas posnatales.
Introduction
El cerebelo ha sido reconocido durante mucho tiempo como un circuito neuronal importante que coordina el movimiento voluntario1. Recibe la entrada de las amplias franjas de la neuroeje, que incluye información proprioceptiva de la periferia, con el fin de afinar la salida del motor y coordinar el movimiento. Más recientemente, también se ha implicado en la regulación de la cognición y las emociones mediante el uso potencial de redes de procesamiento de información similares2,3,4.
El cerebelo adulto se compone de una corteza cerebelosa externa y materia blanca interna. Intercalados dentro de estas estructuras son núcleos intracentesis retorcedos profundos. Al igual que el resto del sistema nervioso, el desarrollo del cerebelo es impulsado por la proliferación de células progenitoras multipotentes (células madre) que migran y se diferencian para producir esta estructura bien organizada. En desarrollo temprano (E10.5–E13.5), un nicho de tallo ventricular alrededor del cuarto ventrículo en desarrollo genera neuronas GABAérgicas (es decir, células Purkinje, células Lugaro, células Golgi) junto con Bergmann glia5,,6,7,8.
Más tarde en desarrollo (semana postnatal uno), un segundo nicho de células madre en el labio rombico genera progenitores QUE expresan MATH1- y Nestin que dan lugar a neuronas de gránulos excitatorios99,10,,11,,12. Recientemente se ha descrito un tercer nicho de células madre13. Estas células expresan prominina-1 (también conocida como CD133), una glicoproteína que abarca membranas y define un subconjunto de células madre en el intestino y los sistemas hematopoyéticos14,,15,,16. El mapeo del destino in vivo muestra que estas células madre generan interneuronas clave de capa molecular (es decir, células de cesta y células estelares), junto con astrocitos, durante las tres primeras semanas postnatales. En el pasado, ha sido difícil estudiar estas células in vitro porque los métodos anteriores han requerido técnicas costosas y que consumen mucho tiempo (es decir, clasificación celular activada por fluorescencia [FACS]) que dependen de la tinción de prominina-112,13,17. Este protocolo describe un método basado en inmunomagnética para el aislamiento de estas células madre que luego se puede cultivar y diferenciar fácilmente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las células madre cerebelosas promininas-1 que expresan residen en la materia blanca prospectiva durante las primeras 3 semanas de vida postnatal. Su proliferación está estrechamente controlada por la vía sónica del erizo apoyada por las células de Purkinje17. Estas células madre / progenitores contribuyen a las interneuronas GABAérgicas de nacimiento posterior llamadas células de la cesta y células estelares. Estas interneuronas residen en la capa molecular, donde sinapsis en las célul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del laboratorio Opal por sus sugerencias. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NIH 1RO1 NS062051 y 1RO1NS08251 (Opal P)
Materials
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| culture plates ultra – low attachment | Corning | 3473 | |
| cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/ml |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/ml) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/ml |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40um |
References
- Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
- Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior. Science. 363, (2019).
- Sathyanesan, A., et al. Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders. Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).
- Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. Cerebellar granule cells encode the expectation of reward. Nature. 544, 96-100 (2017).
- Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum. Cerebellum. , (2019).
- Seto, Y., et al. Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum. Nature Communication. 5, 3337 (2014).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).
- Koziol, L. F., et al. Consensus paper: the cerebellum’s role in movement and cognition. Cerebellum. 13, 151-177 (2014).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).
- Toren, A., et al. CD133-positive hematopoietic stem cell “stemness” genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia. Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).
- Zhu, L., et al. Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation. Nature. 457, 603-607 (2009).
- Man, S. M., et al. Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer. Cell. 162, 45-58 (2015).
- Fleming, J. T., et al. The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors. Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).
- Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1. Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).
- Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor. Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).
- Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor. Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).
- Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum. Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).
- Parmigiani, E., et al. Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages. Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).
- Wojcinski, A., et al. Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors. Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).
- Yang, Z., Joyner, A. L. YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum. Developmental Biology. 1606 (19), 30207 (2019).
- Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83, 518-532 (2014).
- Eberhart, C. G. Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups. Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).
- Takahashi, M., et al. CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells. Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).
