Postnatal Fare Serebellum prominin-1+ Kök Hücrelerin Safifikasyon
Summary
Burada gösterilen, postnatal fare beyincik beyaz madde kök hücreleri arındırmak, kültür ve ayırt etmek için etkili ve uygun maliyetli bir yöntemdir.
Abstract
En serebellar nöronlar iki embriyonik kök nişler ortaya çıkar: bir eşkenar dudak niş, tüm serebellar uyarıcı glutamaterjik nöronlar oluşturur, ve ventriküler zon niş, hangi inhibitör GABAerjik Purkinje hücreleri oluşturur, hangi derin serebellar çekirdekleri ve Bergman glia oluşturan nöronlar vardır. Son zamanlarda, üçüncü bir kök hücre niş ventriküler bölge niş ikincil bir germinal bölge olarak ortaya çıkar tarif edilmiştir. Bu nişin hücreleri hücre yüzeyi belirteci prominin-1 ile tanımlanır ve postnatal serebellumun gelişen beyaz maddesine lokalize edilir. Bu niş postnatal olarak üretilen serebellar astrositler ile birlikte geç doğan moleküler tabaka GABAerjik internöronlar için hesaplar. Gelişimsel rollerine ek olarak, bu niş nörodejenerasyon ve tümörigenezde rol alması açısından çevirisel önem kazanmaktadır. Bu hücrelerin biyolojisi, arınma için etkili tekniklerin eksikliği nedeniyle deşifre etmek zor olmuştur. Burada gösterildiği gibi bu postnatal serebellar kök hücreleri arındırmak, kültür ve ayırt etmek için etkili yöntemler vardır.
Introduction
Serebellum uzun gönüllü hareket koordine önemli bir nöronal devre olarak kabul edilmiştir1. Motor çıktısını ince ayarlayabilmek ve hareketi koordine etmek için çevreden proprioseptif bilgi içeren nöroaksinin geniş alanlarından giriş alır. Daha yakın zamanda, aynı zamanda potansiyel olarak benzer,bilgi işleme ağları2,3,4kullanarak biliş ve duyguların düzenlenmesinde karıştığı olmuştur.
Erişkin serebellum bir dış serebellar korteks ve iç beyaz madde oluşur. Bu yapıların içinde serpiştirilmiş derin intracerebellar çekirdekleri vardır. Sinir sisteminin geri kalanına benzer şekilde, beyincik gelişimi göç ve bu iyi organize yapı verim farklılaştırmak multipotent progenitor hücrelerinin (kök hücreler) çoğalması tarafından tahrik edilir. Erken gelişimde (E10.5–E13.5), gelişmekte olan dördüncü ventrikül etrafında bir ventriküler kök niş GABAerjik nöronlar üretir (yani, Purkinje hücreleri, Lugaro hücreleri, Golgi hücreleri) Bergmann gliailebirlikte 5,6,7,8.
Daha sonra geliştirme (doğum sonrası hafta bir), eşkenar dudak ikinci bir kök hücre niş MATEMATİk üretir- ve Nestin ifade ataları uyarıcı granül nöronlar 9,9,10,11,12. Son zamanlarda üçüncü bir kök hücre niş tarif edilmiştir13. Bu hücreler prominin-1 (CD133 olarak da bilinir), bağırsak ve hematopoetik sistemlerde kök hücrelerin bir alt kümesi tanımlayan bir membran yayılan glikoprotein14,15,16ifade . In vivo kader haritalama bu kök hücrelerin ilk üç doğum sonrası hafta boyunca, astrositler ile birlikte anahtar moleküler tabaka internöronlar (yani, sepet hücreleri ve stellat hücreleri) oluşturmak gösterir. Geçmişte, önceki yöntemler prominin-1 boyama12,13,,17bağımlı pahalı ve zaman alıcı teknikler (yani, floresan-aktive hücre sıralama [FACS]) gerekli olduğu için bu hücreleri in vitro çalışmak zor olmuştur. Bu protokol, bu kök hücrelerin izolasyonu için daha sonra kolayca kültürlenebilir ve ayırt edilebilir bir immünomanyetik tabanlı yöntemi açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prominin-1-ifade serebellar kök hücreler postnatal yaşamın ilk 3 haftasında prospektif beyaz maddede bulunur. Onların çoğalması sıkıca Purkinje hücreleri tarafından desteklenen sonik kirpi yolu tarafından kontrol edilir17. Bu kök hücre / ataları sepet hücreleri ve stellat hücreleri olarak adlandırılan daha sonra doğan GABAerjik interneurons katkıda bulunur. Bu internöronlar moleküler tabakada ikamet, Onlar Purkinje hücreleri üzerine sinaps ve HEYKEL PC topografyası ve G…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Opal laboratuvar üyelerine önerileri için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH hibe tarafından desteklendi 1RO1 NS062051 ve 1RO1NS08251 (Opal P)
Materials
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| culture plates ultra – low attachment | Corning | 3473 | |
| cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/ml |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/ml) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/ml |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40um |
References
- Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
- Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior. Science. 363, (2019).
- Sathyanesan, A., et al. Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders. Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).
- Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. Cerebellar granule cells encode the expectation of reward. Nature. 544, 96-100 (2017).
- Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum. Cerebellum. , (2019).
- Seto, Y., et al. Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum. Nature Communication. 5, 3337 (2014).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).
- Koziol, L. F., et al. Consensus paper: the cerebellum’s role in movement and cognition. Cerebellum. 13, 151-177 (2014).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).
- Toren, A., et al. CD133-positive hematopoietic stem cell “stemness” genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia. Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).
- Zhu, L., et al. Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation. Nature. 457, 603-607 (2009).
- Man, S. M., et al. Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer. Cell. 162, 45-58 (2015).
- Fleming, J. T., et al. The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors. Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).
- Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1. Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).
- Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor. Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).
- Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor. Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).
- Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum. Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).
- Parmigiani, E., et al. Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages. Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).
- Wojcinski, A., et al. Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors. Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).
- Yang, Z., Joyner, A. L. YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum. Developmental Biology. 1606 (19), 30207 (2019).
- Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83, 518-532 (2014).
- Eberhart, C. G. Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups. Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).
- Takahashi, M., et al. CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells. Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).
