Очистка Проминина-1- Стволовые клетки от постнатального мышиного церебеллума
Summary
Демонстрируется здесь является эффективным и экономически эффективным методом для очистки, культуры и дифференцировать белые стволовые клетки материи от послеродового мозжечка мыши.
Abstract
Большинство мозжечковых нейронов возникают из двух эмбриональных стволовых ниш: ромбические губы нишу, которая генерирует все мозжечковые возбуждающие глутамамергические нейроны, и желудочковой ниши зоны, которая генерирует ингибирующие GABAergic Purkinje клеток, которые являются нейронами, которые составляют глубокие ядра мочеиссожиек и Бергман. Недавно была описана третья ниша стволовых клеток, которая возникает как второстепенная зародышевая зона из ниши желудочковой зоны. Клетки этой ниши определяются маркером поверхности клеток проминин-1 и локализованы в развивающемся белом веществе послеродового мозжечка. Эта ниша приходится конце родился молекулярный слой ГАМК-интернейронов наряду с послеродовой генерируемых мозжечковых астроцитов. В дополнение к их роли в развитии, эта ниша приобретает переводное значение в отношении его участия в нейродегенерации и опухолевого генезиза. Биологию этих клеток было трудно расшифровать из-за отсутствия эффективных методов их очистки. Здесь демонстрируются эффективные методы очищения, культуры и дифференцирования этих послеродовых стволовых клеток мозжечка.
Introduction
Мозжечок уже давно признан в качестве основного нейрональной цепи координации добровольного движения1. Он получает входные данные из широких полос нейрооаксиса, который включает в себя проприоцептивную информацию с периферии, с тем чтобы точно настроить выход двигателя и координировать движение. В последнее время он также был вовлечен в регулирование познания и эмоции, потенциально используя аналогичные сети обработки информации2,3,4.
Взрослый мозжечок состоит из внешней мозжечковой коры и внутреннего белого вещества. Перемежаются в этих структурах глубоко интрейреблярных ядер. Как и в остальной части нервной системы, развитие мозжечка обусловлено распространением многопотентных клеток-прародителей (стволовых клеток), которые мигрируют и дифференцируются, чтобы дать эту хорошо организованную структуру. В начале развития (E10.5-E13.5), желудочковой стволовой ниши вокруг развивающихся четвертого желудочка генерирует ГАМК нейронов (т.е., Purkinje клеток, Лугаро клетки, клетки Golgi) вместе с Бергманн глия5,6,7,8.
Позже в развитии (послеродовая неделя один), вторая ниша стволовых клеток в ромбической губы генерирует MATH1- и Nestin-выражения прародителей, которые приводят к возбуждающим гранул нейронов9,10,11,12. Недавно третья ниша стволовых клеток была описана13. Эти клетки выражают проминин-1 (также известный как CD133), мембранно-охватывающий гликопротеин, который определяет подмножество стволовых клеток в кишечнике и гематопогетических системах14,15,16. Картирование судьбы vivo показывает, что эти стволовые клетки генерируют ключевые молекулярные интернейроны (т.е. клетки корзины и стеллатные клетки), наряду с астроцитами, в течение первых трех послеродовых недель. В прошлом, было трудно изучить эти клетки в пробирке, потому что предыдущие методы требуют дорогостоящих и трудоемких методов (т.е. флуоресценция активированных клеток сортировки »FACS» которые зависят от prominin-1 окрашивание12,13,17. Этот протокол описывает иммуномагнитный метод изоляции этих стволовых клеток, которые затем могут быть легко культивированы и дифференцированы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Проминин-1-выражения мозжечковые стволовые клетки находятся в перспективных белого вещества в течение первых 3 недель послеродовой жизни. Их пролиферация жестко контролируется звуковым пути ежа поддерживается Purkinje клетки17. Эти стволовые клетки / прародители способствуют…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов лаборатории Opal за их предложения. Эта работа была поддержана грантами NIH 1RO1 NS062051 и 1RO1NS08251 (Opal P)
Materials
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| culture plates ultra – low attachment | Corning | 3473 | |
| cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/ml |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/ml) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/ml |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40um |
References
- Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
- Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior. Science. 363, (2019).
- Sathyanesan, A., et al. Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders. Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).
- Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. Cerebellar granule cells encode the expectation of reward. Nature. 544, 96-100 (2017).
- Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum. Cerebellum. , (2019).
- Seto, Y., et al. Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum. Nature Communication. 5, 3337 (2014).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).
- Koziol, L. F., et al. Consensus paper: the cerebellum’s role in movement and cognition. Cerebellum. 13, 151-177 (2014).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).
- Toren, A., et al. CD133-positive hematopoietic stem cell “stemness” genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia. Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).
- Zhu, L., et al. Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation. Nature. 457, 603-607 (2009).
- Man, S. M., et al. Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer. Cell. 162, 45-58 (2015).
- Fleming, J. T., et al. The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors. Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).
- Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1. Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).
- Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor. Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).
- Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor. Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).
- Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum. Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).
- Parmigiani, E., et al. Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages. Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).
- Wojcinski, A., et al. Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors. Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).
- Yang, Z., Joyner, A. L. YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum. Developmental Biology. 1606 (19), 30207 (2019).
- Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83, 518-532 (2014).
- Eberhart, C. G. Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups. Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).
- Takahashi, M., et al. CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells. Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).
