Summary

Reinigung von Prominin-1+ Stammzellen aus postnatalem Maus-Zerebellum

Published: April 12, 2020
doi:

Summary

Hier wird eine effiziente und kostengünstige Methode zur Reinigung, Kultur und Unterscheidung von Stammzellen aus weißer Materie von postnatalen Maus-Kleinhirnen demonstriert.

Abstract

Die meisten kleinhirnförmigen Neuronen entstehen aus zwei embryonalen Stammnischen: einer rhombischen Lippennische, die alle zwieslösenden erregenden glutamatergen Neuronen erzeugt, und einer ventrikulären Zonennische, die die hemmenden GABAerge Purkinje-Zellen erzeugt, die Neuronen sind, die die tiefen kleinhirnigen Kerne und Bergman-Glia bilden. Kürzlich wurde eine dritte Stammzellnische beschrieben, die als sekundäre Keimzone aus der ventrikulären Zonennische entsteht. Die Zellen dieser Nische werden durch den Zelloberflächenmarker Prominin-1 definiert und sind auf die sich entwickelnde weiße Materie des postnatalen Kleinhirns lokalisiert. Diese Nische ist für die spätgeborene molekulare Schicht GABAerge interneurons zusammen mit postnatal erzeugten Kleinhirn-Astrozyten. Neben ihrer Entwicklungsrolle gewinnt diese Nische hinsichtlich ihrer Beteiligung an Neurodegeneration und Tumorgenese an translationaler Bedeutung. Die Biologie dieser Zellen war aufgrund des Mangels an effizienten Techniken für ihre Reinigung schwer zu entziffern. Hier werden effiziente Methoden zur Reinigung, Kultur und Differenzierung dieser postnatalen Kleinhirnstammzellen demonstriert.

Introduction

Das Kleinhirn ist seit langem als ein wichtiger neuronaler Schaltkreis anerkannt, der die freiwillige Bewegung1koordiniert. Es erhält Input aus den weiten Schwaden der Neuroaxis, die propriozeptive Informationen aus der Peripherie enthält, um die Motorleistung zu optimieren und die Bewegung zu koordinieren. In jüngerer Zeit wurde es auch in die Regulierung von Kognition und Emotionen durch potenziell die Verwendung ähnlicher Informationsverarbeitungsnetzwerke2,3,4.

Das erwachsene Kleinhirn besteht aus einem äußeren Kleinhirnkortex und einer inneren weißen Materie. Zwischen diesen Strukturen sind tief intracerebellare Kerne. Ähnlich wie beim Rest des Nervensystems wird die Entwicklung des Kleinhirns durch die Proliferation multipotenter Vorläuferzellen (Stammzellen) angetrieben, die migrieren und differenzieren, um diese gut organisierte Struktur zu ergeben. In der frühen Entwicklung (E10.5–E13.5) erzeugt eine ventrikuläre Stammnische um den sich entwickelnden vierten Ventrikel GABAerge Neuronen (d.h. Purkinje-Zellen, Lugaro-Zellen, Golgi-Zellen) zusammen mit Bergmann glia5,6,7,8.

Später in der Entwicklung (postnatale Woche eins) erzeugt eine zweite Stammzellnische in der rhomben Lippe MATH1- und Nestin-exezigraphische Vorläufer, die zu erregenden Granulatneuronen9,10,11,12führen. Kürzlich wurde eine dritte Stammzellnische beschrieben13. Diese Zellen exprimieren Prominin-1 (auch bekannt als CD133), ein membranübergreifendes Glykoprotein, das eine Teilmenge von Stammzellen im Darm und hämatopoetischen Systemen14,15,16definiert. Die In-vivo-Schicksalskartierung zeigt, dass diese Stammzellen in den ersten drei postnatalen Wochen wichtige molekulare Schicht-Interneuronen (d. h. Korbzellen und stellate Zellen) zusammen mit Astrozyten erzeugen. In der Vergangenheit war es schwierig, diese Zellen in vitro zu untersuchen, da frühere Methoden kostspielige und zeitaufwändige Techniken (d. h. fluoreszaktivierte Zellsortierung [FACS]) erforderten, die von Prominin-1-Färbung12,13,17abhängig sind. Dieses Protokoll beschreibt eine immunmagnetische Methode zur Isolierung dieser Stammzellen, die dann leicht kultiviert und differenziert werden kann.

Protocol

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (2011) durchgeführt und von der Northwestern University IACUC (Protokoll IS00011368) genehmigt. 1. Vorbereitung von Lösungen Bereiten Sie gewebedissoziationslösung aus sterilem Phenol rot haltigen Dulbecco Phosphat-gepufferten Saline (DPBS) mit Papain (100 U/ml), Cystein (0,2 mg/ml) und DNase (250 U/ml) vor. Zur Herstellung der DNase-Lösung 100 mg des lyophilisierte…

Representative Results

Prominin-1-positive postnatale Kleinhirnstammzellen bildeten Neurosphären in Neurosphärenmedium reich an Wachstumsfaktoren (EGF und bFGF). Diese Neurosphären waren positiv für Prominin-1-Färbung, der Marker für die Isolierung verwendet, und auch als Fleck für andere Stammzellmarker wie Nestin und GFAP13 (Abbildung 1). Der Stammzellmarker-Ausdruck wurde kultur- und für mindestens acht Passagen20beibehalten. Nach Abzug von Wachstumsfaktor…

Discussion

Prominin-1-exättige Kleinhirnstammzellen befinden sich in den ersten 3 Wochen des postnatalen Lebens in der prospektiven weißen Materie. Ihre Proliferation wird durch den schallenden Igelweg, der von Purkinje-Zellen unterstützt wird, streng kontrolliert17. Diese Stammzellen/Vorläufer tragen zu später geborenen GABAergen Interneuronen bei, die Korbzellen und stellate Zellen genannt werden. Diese Interneuronen befinden sich in der molekularen Schicht, wo sie auf Purkinje-Zellen synapisieren und…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken den Mitgliedern des Opal-Labors für ihre Vorschläge. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Stipendien 1RO1 NS062051 und 1RO1NS08251 (Opal P) unterstützt.

Materials

0.05%Trypsin Thermo Fisher Scientific 25300054 0.05%
2% B27 Gibco; Thermo Fisher Scientific 17504001
2mM EDTA solution Corning 46-034-CI
Anti- Prominin-1 microbeads Miltenyi Biote 130-092-333
bovine serum albumin Sigma A9418
Column MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
culture plates ultra – low attachment Corning 3473
cysteine Sigma C7880
DNase Sigma D4513-1VL 250 U/ml
Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline Thermo Fisher Scientific 14040141
Hank's balanced salt solution-HBSS Gibco 14025-092
Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor Promega G507A 20 ng/ml
Human recombinant Epidermal Growth Factor Promega G502A 20 ng/ml
Leukemia Inhibitory Factor Sigma L5158
l-glutamine Gibco 25030081
Microscopy Lieca TCS SP5 confocal microscopes
MiniMACS separator Miltenyi Biotec 130-042-102
mouse anti-Prominin-1 Affymetrix eBioscience 14-1331 1 in 100
Nestin Abcam ab27952 1 in 200
Neurobasal medium Thermo Fisher 25030081
O4 Millopore MAB345
Papain Worthington LS003126 (100 U/ml)
Platelet- Derived Growth Factor Sigma H8291 10 ng/ml
Poly-D-Lysine Sigma P6407
rabbit anti-tubulin, b-III Sigma T2200 1 in 500
Rabit anti-GFAP Dako Z0334 1 in 500
Separation columns-MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Sterile cell strainer Fisher Scientific 22363547 40um

References

  1. Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
  2. Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior. Science. 363, (2019).
  3. Sathyanesan, A., et al. Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders. Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).
  4. Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. Cerebellar granule cells encode the expectation of reward. Nature. 544, 96-100 (2017).
  5. Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum. Cerebellum. , (2019).
  6. Seto, Y., et al. Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum. Nature Communication. 5, 3337 (2014).
  7. Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).
  8. Koziol, L. F., et al. Consensus paper: the cerebellum’s role in movement and cognition. Cerebellum. 13, 151-177 (2014).
  9. Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
  10. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  11. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
  12. Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).
  13. Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).
  14. Toren, A., et al. CD133-positive hematopoietic stem cell “stemness” genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia. Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).
  15. Zhu, L., et al. Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation. Nature. 457, 603-607 (2009).
  16. Man, S. M., et al. Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer. Cell. 162, 45-58 (2015).
  17. Fleming, J. T., et al. The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors. Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).
  18. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).
  19. Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).
  20. Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1. Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).
  21. Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor. Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).
  22. Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor. Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).
  23. Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum. Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).
  24. Parmigiani, E., et al. Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages. Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).
  25. Wojcinski, A., et al. Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors. Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).
  26. Yang, Z., Joyner, A. L. YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum. Developmental Biology. 1606 (19), 30207 (2019).
  27. Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83, 518-532 (2014).
  28. Eberhart, C. G. Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups. Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).
  29. Takahashi, M., et al. CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells. Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).

Play Video

Cite This Article
Edamakanti, C. R., Opal, P. Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum. J. Vis. Exp. (158), e60554, doi:10.3791/60554 (2020).

View Video