טיהור של Prominin-1+ בתאי גזע מתוך עכבר המוח פוסט לידתיים
Summary
הפגינו כאן היא שיטה יעילה וחסכונית כדי לטהר, תרבות, ולהבדיל בתאי גזע החומר הלבן מתוך המוח הימני של העכבר.
Abstract
הנוירונים המוח ביותר לנבוע משני נישות גזע עובריים: נישה שפתיים מעובית, אשר מייצרת את כל הנוירונים glutamatergic המוח מרגש, ואת נישה אזור חדרית, אשר מייצרת את העכבות GABAergic מעצור התאים Purkinje, אשר הם נוירונים המהווים את גרעיני המוח עמוק ברגמן גליה. לאחרונה, נישה תא גזע שלישי תוארה שנוצר כאזור נבטי משני מנישה אזור חדרית. התאים של נישה זו מוגדרים על ידי משטח התא סמן prominin-1 והם מותאמים לחומר הלבן המתפתח של המוח התחתי לפני הלידה. זה נישה חשבונות עבור שכבה מולקולרית מאוחר נולד GABAergic האינטרנוירונים יחד עם שנוצר postnatally המוח האסטרוציטים. בנוסף לתפקידם ההתפתחותי, נישה זו מקבלת חשיבות טרנסלתית לגבי מעורבותו בניוון שיניים ובטווריגנזה. הביולוגיה של תאים אלה היה קשה לפענח בגלל חוסר טכניקות יעיל לטיהור שלהם. הפגינו כאן הם שיטות יעילות כדי לטהר, תרבות, ולהבדיל אלה תאי גזע לאחר הלידה.
Introduction
המוח הקצר מזוהה כאחד המעגלים העיקריים של תיאום תנועה מרצון1. הוא מקבל קלט מתוך העיטורים הרחבים של הציר הנוירולוגי, הכולל מידע באמצעות הפריה הפריפריה, כדי לכוונן את התפוקה ולתאם את התנועה. לאחרונה, הוא גם היה מעורב בוויסות ההכרה והרגשות על-ידי שימוש ברשתות עיבוד מידע דומות2,3,4.
המוח החלק המבוגר מורכב מקליפת מוח חיצונית וחומר לבן פנימי. בתוך מבנים אלה הם גרעיני תאיים עמוק. בדומה לשאר מערכת העצבים, ההתפתחות של המוח ה, הוא מונע על ידי התפשטות של תאים בעלי ממון רב עוצמה (תאי גזע) להגר ולהבדיל כדי להניב מבנה מאורגן היטב. בהתפתחות מוקדמת (e 10.5 – e 13.5), נישה גזע חדרית סביב החדר הרביעי המתפתח מייצר נוירונים gabaergic (כלומר, התאים purkinje, לוגרו תאים, התאים golgi) יחד עם ברז גליה5,6,7,8.
מאוחר יותר בפיתוח (postnatal שבוע אחד), נישה תא גזע שני ב שפתו מעובית מייצר MATH1-ו nestin הביע ושלתי כי להצמיח מגרריר הנוירונים הנירע9,10,11,12. לאחרונה הוגדרה נישה של תא גזע שלישי13. תאים אלה express prominin-1 (הידוע גם כ-CD133), גליקופרוטאין מפורש מקרום המגדיר מערכת משנה של תאי גזע במעי ומערכות המטטיות14,15,16. בשנת vivo מיפוי הגורל מראה כי תאי גזע אלה לייצר מפתח מולקולרי שכבה interneurons (כלומר, תאי סל ותאי stellate), יחד עם astrocytes, במהלך שלושת הימים הראשונים לאחר הלידה. בעבר, היה קשה לחקור את התאים האלה בתוך מבחנה משום שיטות קודמות נדרשו טכניקות יקרות זמן רב (כלומר, מיון המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית [facs]) התלויים על12prominin-1כתמים 12,13,17. פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת החיסונית לבידוד של תאי גזע אלה שיכולים לאחר מכן להיות תרבותי בקלות והבדיל.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prominin-1-ביטוי המוח בתאי גזע מתגוררים בחומר הלבן פוטנציאליים במהלך 3 השבועות הראשונים של החיים לאחר הלידה. התפשטות שלהם נשלטת בחוזקה על ידי מסלול קיפוד סוניק נתמך על ידי התאים Purkinje17. אלה תאי גזע/ושלתי לתרום בלידה מאוחרת יותר GABAergic הנקרא תאי סל ו stellate תאים. אלה נוירונים מתגוררים בש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי המעבדה של אופל על הצעותיהם. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים 1RO1 NS062051 ו 1RO1NS08251 (אופל P)
Materials
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| culture plates ultra – low attachment | Corning | 3473 | |
| cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/ml |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/ml) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/ml |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40um |
References
- Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
- Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior. Science. 363, (2019).
- Sathyanesan, A., et al. Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders. Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).
- Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. Cerebellar granule cells encode the expectation of reward. Nature. 544, 96-100 (2017).
- Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum. Cerebellum. , (2019).
- Seto, Y., et al. Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum. Nature Communication. 5, 3337 (2014).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).
- Koziol, L. F., et al. Consensus paper: the cerebellum’s role in movement and cognition. Cerebellum. 13, 151-177 (2014).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).
- Toren, A., et al. CD133-positive hematopoietic stem cell “stemness” genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia. Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).
- Zhu, L., et al. Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation. Nature. 457, 603-607 (2009).
- Man, S. M., et al. Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer. Cell. 162, 45-58 (2015).
- Fleming, J. T., et al. The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors. Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).
- Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1. Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).
- Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor. Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).
- Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor. Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).
- Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum. Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).
- Parmigiani, E., et al. Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages. Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).
- Wojcinski, A., et al. Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors. Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).
- Yang, Z., Joyner, A. L. YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum. Developmental Biology. 1606 (19), 30207 (2019).
- Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83, 518-532 (2014).
- Eberhart, C. G. Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups. Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).
- Takahashi, M., et al. CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells. Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).
