Purificação de Prominin-1+ Células-tronco do Rato Pós-Natal Cerebellum
Summary
Demonstrado aqui é um método eficiente e econômico para purificar, cultura e diferenciar células-tronco de matéria branca do cerebelo de rato pós-natal.
Abstract
A maioria dos neurônios cerebelares surge de dois nichos embrionários: um nicho labial rombônico, que gera todos os neurônios glutamatergicos excitatórios cerebelares, e um nicho de zona ventricular, que gera as células purkinje sinógicas inibidoras, que são neurônios que constituem os núcleos cerebelares e a glia de Bergman. Recentemente, um terceiro nicho de células-tronco foi descrito que surge como uma zona germinal secundária do nicho da zona ventricular. As células deste nicho são definidas pelo marcador de superfície celular prominin-1 e são localizadas para a matéria branca em desenvolvimento do cerebelo pós-natal. Este nicho explica a camada molecular de nascimento tardio dos interneurônios GABAergic, juntamente com os astrócitos cerebelares gerados no pós-natal. Além de seu papel de desenvolvimento, esse nicho vem ganhando importância translacional no que diz respeito ao seu envolvimento na neurodegeneração e tumorigênese. A biologia dessas células tem sido difícil de decifrar devido à falta de técnicas eficientes para sua purificação. Aqui estão demonstrados métodos eficientes para purificar, cultura rastamente e diferenciar essas células-tronco cerebelares pós-natal.
Introduction
O cerebelo foi há muito reconhecido como um grande circuito neuronal que coordena o movimento voluntário1. Ele recebe entrada das amplas faixas do neuroeixo, que inclui informações proprioceptivas da periferia, de modo a ajustar a saída do motor e coordenar o movimento. Mais recentemente, também foi implicado na regulação da cognição e das emoções por potencialmente usar redes de processamento de informações semelhantes2,3,4.
O cerebelo adulto é composto por um córtex cerebelar externo e matéria branca interior. Intercalados dentro dessas estruturas são núcleos intracerebelares profundos. Semelhante ao resto do sistema nervoso, o desenvolvimento do cerebelo é impulsionado pela proliferação de células progenitoras multipotentes (células-tronco) que migram e se diferenciam para produzir essa estrutura bem organizada. No desenvolvimento precoce (E10.5-E13.5), um nicho ventricular em torno do quarto ventrículo em desenvolvimento gera neurônios GABAergic (ou seja, células purkinje, células de Lugaro, células Golgi) juntamente com Bergmann glia5,6,7,8.
Mais tarde em desenvolvimento (semana pós-natal um), um segundo nicho de células-tronco no lábio rombico gera progenitores expressivos math1 e nestin que dão origem a neurônios de granulo excitatório9,,10,11,12. Recentemente, um terceiro nicho de células-tronco foi descrito13. Essas células expressam promininina-1 (também conhecida como CD133), uma glicoproteína de membrana que define um subconjunto de células-tronco no intestino e sistemas hematopoiéticos14,15,16. O mapeamento do destino in vivo mostra que essas células-tronco geram interneurônios de camada molecular chave (ou seja, células cestas e células estelares), juntamente com astrócitos, durante as três primeiras semanas pós-natal. No passado, tem sido difícil estudar essas células in vitro porque métodos anteriores exigiram técnicas caras e demoradas (ou seja, classificação celular ativada por fluorescência [FACS]) que dependem da coloração prominin-112,13,17. Este protocolo descreve um método de base imunomagnética para o isolamento dessas células-tronco que podem então ser facilmente cultivadas e diferenciadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
As células-tronco cerebelares expressas em prominin-1 residem na matéria branca em potencial durante as primeiras 3 semanas de vida pós-natal. Sua proliferação é fortemente controlada pela via de ouriço sônico apoiada pelas células Purkinje17. Essas células-tronco/progenitores contribuem para interneurônios GABAergic os nascidos posteriormente chamados células cestas e células estelares. Estes interneurônios residem na camada molecular, onde sinapse nas células purkinje e esculpe a …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos membros do laboratório opala por suas sugestões. Este trabalho foi apoiado pelas subvenções do NIH 1RO1 NS062051 e 1RO1NS08251 (Opal P)
Materials
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| culture plates ultra – low attachment | Corning | 3473 | |
| cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/ml |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/ml) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/ml |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40um |
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