Purification de la prominine-1- Cellules souches de Cerebellum souris postnatale
Summary
Démontré ici est une méthode efficace et rentable pour purifier, la culture, et différencier les cellules souches de matière blanche du cervelet de souris postnatale.
Abstract
La plupart des neurones cérébellaires proviennent de deux niches souches embryonnaires : une niche rhombique pour les lèvres, qui génère tous les neurones glutamatergiques excitatoires cérélotés, et une niche de zone ventriculaire, qui génère les cellules inhibitrices de Purkinje GABAergic, qui sont des neurones qui constituent les noyaux cérébellaires profonds et les gliax de Bergman. Récemment, une troisième niche de cellules souches a été décrite qui se présente comme une zone germinale secondaire de la niche de zone ventriculaire. Les cellules de cette niche sont définies par le marqueur de surface cellulaire prominin-1 et sont localisées à la matière blanche en développement du cervelet postnatal. Ce créneau explique la couche moléculaire défunte GABAergic interneurons avec les astrocytes cérébellaires générés par la postnaline. En plus de leur rôle de développement, ce créneau gagne en importance translationnelle en ce qui concerne son implication dans la neurodégénérescence et la tumorigenesis. La biologie de ces cellules a été difficile à déchiffrer en raison d’un manque de techniques efficaces pour leur purification. Les méthodes efficaces pour purifier, culture et différencier ces cellules souches cérébellaires postnatales sont démontrées ici.
Introduction
Le cervelet a longtemps été reconnu comme un circuit neuronal majeur coordonnant le mouvement volontaire1. Il reçoit l’apport des larges pans des neuroaxis, qui comprend des informations proprioceptives de la périphérie, afin de régler finement la sortie du moteur et coordonner le mouvement. Plus récemment, il a également été impliqué dans la régulation de la cognition et des émotions en utilisant potentiellement des réseaux similaires de traitement de l’information2,3,4.
Le cervelet adulte est composé d’un cortex cérébellaire externe et de matière blanche intérieure. Entrecoupés dans ces structures sont des noyaux intracerebellaires profonds. Semblable au reste du système nerveux, le développement du cervelet est entraîné par la prolifération des cellules progénitrices multipotentes (cellules souches) qui migrent et se différencient pour donner cette structure bien organisée. Dans le développement précoce (E10.5-E13.5), une niche de tige ventriculaire autour du quatrième ventricule en développement génère des neurones GABAergic (c.-à-d. cellules Purkinje, cellules Lugaro, cellules Golgi) avec Bergmann glia5,6,7,8.
Plus tard dans le développement (semaine postnatale un), une deuxième niche de cellules souches dans la lèvre rhombique génère MATH1- et Nestin-exprimant les ancêtres qui donnent lieu à des neurones granule excitatoires9,10,11,12. Récemment, une troisième niche de cellules souches a été décrite13. Ces cellules expriment la prominine-1 (également connu sous le nom de CD133), une glycoprotéine couvrant la membrane qui définit un sous-ensemble de cellules souches dans l’intestin et les systèmes hématopoïétiques14,15,16. La cartographie du destin in vivo montre que ces cellules souches génèrent des interneurons de couches moléculaires clés (c.-à-d. les cellules de panier et les cellules de stellate), ainsi que les astrocytes, pendant les trois premières semaines postnatales. Dans le passé, il a été difficile d’étudier ces cellules in vitro parce que les méthodes antérieures ont exigé des techniques coûteuses et chronophages (c.-à-d., le tri cellulaire activé par la fluorescence [FACS]) qui dépendent de la coloration de prominine-112,13,17. Ce protocole décrit une méthode immunomagnétique-basée pour l’isolement de ces cellules souches qui peuvent alors être facilement cultivées et différenciées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les cellules souches cérébellaires prominin-1-exprimant résident dans la matière blanche prospective pendant les 3 premières semaines de la vie postnatale. Leur prolifération est étroitement contrôlée par la voie sonore hérisson soutenu par les cellules Purkinje17. Ces cellules souches/progéniteurs contribuent à des interneurons GABAergic nés plus tard appelés cellules de panier et cellules de stellate. Ces interneurons résident dans la couche moléculaire, où ils synapse sur les c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du laboratoire Opal pour leurs suggestions. Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH 1RO1 NS062051 et 1RO1NS08251 (Opal P)
Materials
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| culture plates ultra – low attachment | Corning | 3473 | |
| cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/ml |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/ml) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/ml |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40um |
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