Исследование кишечного барьера Разбивка в живых органоидов
Summary
Здесь мы описываем метод количественной оценки барьерной целостности малых кишечных органоидов. Тот факт, что метод основан на живых органоидов позволяет последовательное исследование различных барьер целостности модулирующих веществ или комбинаций из этого в времени решена образом.
Abstract
Органоиды и трехмерные (3D) клеточные культуры позволяют исследует сложные биологические механизмы и регуляции invitro, что ранее было невозможно в монослойной классической клеточной культуре. Кроме того, монослойные клеточные культуры являются хорошими системами моделей in vitro,. но не представляют собой сложные процессы и функции клеточной дифференциации, которые опираются на 3D-структуру. Это до сих пор было возможно только в экспериментах на животных, которые являются трудоемкими, отнимает много времени, и трудно оценить оптическими методами. Здесь мы описываем анализ количественно определить целостность барьера с течением времени в жизни малых кишечных органов мыши. Для проверки нашей модели мы применили интерферон гамма (IFN-я) в качестве положительного контроля для разрушения барьеров и органоидов, полученных из IFN-я рецептор 2 выбить мышей в качестве отрицательного контроля. Анализ позволил нам определить влияние ИФН-З на целостность кишечного барьера и индуцированную деградацию плотных соединений, клавдий-2, -7 и -15. Этот анализ также может быть использован для исследования влияния химических соединений, белков, токсинов, бактерий или зондов, полученных пациентом, на целостность кишечного барьера.
Introduction
Целостность эпителиального барьера поддерживается апикальным соединением (AJC), который состоит из плотного соединения (TJ) и присоединения соединения (AJ) белков1. Поляризованная структура АЕК имеет решающее значение для его функции in vivo. Дисрегуляция AJC присутствует при различных заболеваниях и, как предполагается, является важным триггером воспалительного патогенеза кишечника. Потеря функции кишечного барьера представляет собой инагитирующее событие заболевания. Следующие транслокации сопутствующих бактерий и воспалительных реакций являются болезненными последствиями2.
Различные модели in vitro и in vivo были разработаны. для изучения регулирования AJC. Transwell асса основанна на двухмерных (2D) клеточных монослойах, которые были получены из опухолевых клеточных линий. Эти системы хорошо оценить с помощью оптических и биохимических методов и позволяют анализ ировать многие образцы в то же время, но не имеют многих особенностей первичных клеток и процессов дифференциации, присутствующих в vivo. Исследование целостности барьера также возможно в животных моделях. В терминальных экспериментах, влияние специфических обработок in vivo на проницаемость всего intestine можно сотвиную. Однако эти модели требуют большого количества животных, и они не позволяют детально визуализировать основные молекулярные процессы. В настоящее время доступны улучшенные 3D-модели in vitro, которые тесно переизглашают процессы дифференциации клеток, поляризацию клеток и представляют структуру склепового кишечника3. Применение 3D кишечных органоидов для функционального анализа требует адаптации доступных методов из 2D-моделей. Здесь мы описываем модель для исследования целостности кишечного барьера в жизни малых кишечных органов мыши. Анализ был создан для изучения влияния ИФН-З на целостность барьера и соответствующих плотных белков соединения8.
В отличие от техники, применяемой Лесли4, Зитек5, или Пирс6, который измеряет флуоресценцию после удаления люцифера желтый (LY) из среды, наш подход позволяет количественной оценки светящегося поглощения фторофора с течением времени. Таким образом, результат представляет собой динамическое поглощение кинетической и наш ассе может применяться дополнительные стимулы или ингибиторы в ходе эксперимента. Тот факт, что оба ассы измеряют поглощение от внешней базолатеральной стороны к внутренней атикальной поверхности, явно контрастирует с ситуацией in vivo. В модели, описанной Hill et al.7,эта тема была изучена. При микроинъекции флюорофора в просвет органоида была количественно определена флуоресценция. Направление диффузии представляет направление, присутствуют в vivo. Технические усилия микроинъекции явно снижает пропускную мощность этого метода. В отличие от описанной здесь модели метод микроинъекций позволяет измерять эффекты, требующие биологической активации на аптической эпителиальной поверхности.
Модель целостности органоидных барьеров, представленная здесь, основана на живой клеточной микроскопии и позволяет анализировать динамические изменения в рамках регулирования АЕК с течением времени. Установка может быть применена для проверки фармакологического воздействия веществ, вызывающих и препятствующих целостности кишечного барьера. Кроме того, модели на основе органидов помогают сократить количество животных, используемых для фармакологических исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот анализ предлагает технику для изучения кишечного барьера целостности в живых органоидов. Весь анализ основан на небольших кишечных органоидов мыши и конфокальные живые клеточные микроскопии. Таким образом, необходимо практиковать правильное обращение с органоидами заранее. После изоляции, органоиды могут быть регулярно разделены и хранятся путем криозамораживая3,9. Для этого асссе мы рекомендуем расщеплять органоиды 48 ч до начала лечения. Этот период дает органоидам возможность полностью закрыть и сформировать сферические структуры. Посев органоидов для эксперимента является важным шагом в рамках ассеи. Чтобы уменьшить индивидуальные вариации обработки, мы рекомендуем рутинную процедуру для процесса посева. Этот шаг имеет решающее значение, и рутинный протокол обработки явно уменьшает экспериментальные вариации.
Во время процедуры посева (шаг 1.7) органоиды фрагментируются повторяющимися пропусками через стандартный наконечник пипетки 10 Зл. Размер поры этого продукта варьируется от компании к компании. Эту процедуру следует практиковать заранее, и результат всегда должен быть проверен фазовой контрастной микроскопией. Как только полученные органоиды достигают желаемого размера, не меняйте процедуру.
Посев органоидов должен быть оптимизирован и адаптирован для доступной микроскопической установки. Чтобы иметь возможность культуры и изображения органоидов, по крайней мере 48 ч, инкубированный микроскоп камеры абсолютно необходимо. Выберите камерный покрывало, которое соответствует вашим требованиям. При посеве органоидов, убедитесь, что сконцентрировать органоиды на поверхности крышки. Это возможно, сохраняя камерный покрывало на пакете со льдом в течение 5 минут после размещения клеточной матричной органоидной подвески. Этот шаг имеет важное значение для повышения качества конфокальной визуализации живых клеток. Особенно ограничено осевое разрешение и рабочее расстояние линз конфокального микроскопа. Чем ближе вы приносите образец к объективу, тем лучше вы можете его изображения и меньше лазерной энергии необходимо возбудить LY флуоресценции.
Фототаксис является важным вопросом, когда дело доходит до живой клеточной микроскопии. В рамках этого ассеа мы исключаем этот вариант. Функциональный AJC виден путем исключения LY из просвета органоида(рисунок 1, PBS). Добавление EGTA в конце эксперимента вызывает поглощение двухвалентных ионов, которые являются кофакторами для белков AJC. LY исключается из проема органоида только в жизненно важных органоидах с функциональным комплексом AJC. В целом, флуоресцентные молекулы могут быть использованы для измерения целостности кишечного барьера. Мы выбрали LY вместо других широко используемых флюорофоров, таких как флуоресцеин помечены dextran, потому что те транспортируются трансклеточно в клетках кишечника из базальных в апический отсек9. Мы также выбрали LY из-за его небольшого размера. LY имеет молекулярный вес 457 Da и, следовательно, облегчает исследование барьера проницаемости для малых молекул. Флуоресцентная молекула должна быть выбрана в зависимости от исследуемого научного вопроса. Поскольку фототоксичные дефекты AJC присутствуют, энергия лазерного возбуждения должна быть уменьшена или интервал изображения расширен. Оптимальным методом конфокальной визуализации для этого исследования является спиннинг диск микроскопии. Соответствующие приборы позволяют конфокальной визуализации с коротким временем воздействия при низкой мощности лазера.
Различные модели уже разработаны для изучения целостности кишечного барьера в пробирке. В то время как использование анализов на основе монослойной линии клеток или экспериментов in vivo сокращается, методы на основе органидов увеличиваются. В отличие от методов, описанных ранее4,,5,,6,,7, наш метод позволяет количественно с течением времени определить функцию барьера. Это позволяет подвергать органоиды дополнительным раздражителям в ходе эксперимента. Здесь мы применяем EGTA в качестве второго стимула в конце эксперимента в качестве положительного контроля.
В отличие от ситуации in vivo, в нашем анализе LY добавляется в среду и проникает органоид из внешней базолатеральной эпителиальной стороны к внутренней апикальной просвет. LY мал и используется только для визуализации герметичности кишечного барьера. Молекулы и стимулы, которые модулируют эпителиальный слой на апикальной поверхности, должны быть введены в просвет органоида7. Чтобы уменьшить экспериментальные усилия и быть в состоянии измерить барьер целостности многих органоидов в то же время, мы решили применить флуоресцентный краситель снаружи.
Мы использовали анализ для исследования функции ИФН-З на плотном стыке мелких органоидов кишечных мышей. Тот факт, что мы смогли проанализировать целостность барьера в живых органоидов предлагает будущие возможности для применения этой техники для описания ингибиторов для воспаления индуцированного распада кишечного барьера. Вещества, которые противодействуют нарушенной барьерной функции, вызванной ИФН-З, могут быть кандидатами на лечение воспалительных заболеваний кишечника, при которых нарушение барьерной функции является одним из патогенных факторов10.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Немецкого исследовательского фонда (DFG) «KFO257», проекта 4 к M.S. и проекта 1 к C.B.; FOR2438, проект 2 до М.С. и E.N. и проект от 5 до C.B.; SFB1181 проект C05 в К.Б.; TRR241, проект A06 в N.B.L. и M.S., проект A03 в C.B., BR5196/2-1 до N.B.L. и BE3686/2 до C.B.; Междисциплинарный центр клинических исследований (ИзКФ) Клинического центра Эрлангена (М.С.Н., Е.Н., и М.Б.), В. Лутц Стифтунг (до М.С.) и Форшунгстифтунг Мизин из Клинического центра Erlangen (до M.S.). Нынешняя работа была выполнена в (частичном) выполнении требований по получению степени доктора марко Барденбахера.
Materials
| 48-well culture plate | Thermo Fisher Scientific | #150687 | |
| 8-well chamber slides | Ibidi | #80826 | |
| 96-well culture plate | Greiner Bio-One | #655101 | |
| Axio Observer.Z1 – spinning disc | Zeiss | excitation laser 488 nm / emission filter 525/25 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Centrifugation tube 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 11507411 | |
| Centrifugation tube 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 10788561 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788-25g | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 431788 | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
| Matrigel, growth factor reduced, phenol red free | Corning | 356231 | Cell matrix solution |
| Mice | The Jackson Laboratory | M. musculus C57/Bl6 | |
| Microscope coverslip | 24×60 mm | ||
| Organoid Growth Medium mouse | Stemcell Technologies | #06005 | |
| Phosphate buffered saline | Biochrom | L182-05 | |
| Recombinant murine IFN-γ | Biolegend | Cat#575304 |
References
- López-Posadas, R., Stürzl, M., Atreya, I., Neurath, M. F., Britzen-Laurent, N. Interplay of GTPases and Cytoskeleton in Cellular Barrier Defects during Gut Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1240 (2017).
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infection and Immunity. 83 (1), 138-145 (2015).
- Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion. Scientific Reports. 5 (1), 16831 (2015).
- Pearce, S. C., et al. Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types. BMC Biology. 16 (1), 19 (2018).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
- Tomita, M., Hotta, Y., Ohkubo, R., Awazu, S. Polarized transport was observed not in hydrophilic compounds but in dextran in Caco-2 cell monolayers. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (3), 330-331 (1999).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
