التحقيق في انهيار الحاجز المعوي في الأعضاء الحية
Summary
هنا نصف تقنية لتحديد سلامة الحاجز من الأعضاء المعوية الصغيرة. حقيقة أن الطريقة تقوم على الكائنات الحية تمكن التحقيق المتتابعة من مختلف سلامة الحاجز تحوير المواد أو تركيبات منها بطريقة زمنية حلها.
Abstract
Organoids وثقافات الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D) تسمح بالتحقيق في الآليات البيولوجية المعقدة واللوائح في المختبر، والتي لم تكن ممكنة في السابق في أحادية ثقافة الخلايا الكلاسيكية. وعلاوة على ذلك، الثقافات خلية أحادية الطبقات جيدة في أنظمة نموذج المختبر ولكن لا تمثل عمليات التمايز الخلوية المعقدة والوظائف التي تعتمد على هيكل 3D. ولم يكن ذلك ممكناً حتى الآن إلا في التجارب على الحيوانات، التي هي شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً ويصعب تقييمها من خلال التقنيات البصرية. هنا نصف القول لتحديد كميا سلامة الحاجز مع مرور الوقت في الذين يعيشون صغيرة الجهازية الماوس المعوي. للتحقق من صحة نموذجنا، قمنا بتطبيق الإنترفيرون غاما (IFN-ο) كتحكم إيجابي لتدمير الحاجز والمنأرغويدات المشتقة من مستقبلات IFN-ο 2 ضرب الفئران كتحكم سلبي. سمح لنا الامتصاص بتحديد تأثير IFN-ο على سلامة الحاجز المعوي والتدهور المستحث لبروتينات التقاطع الضيقة كلودين-2 و-7 و-15. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الإمكانية للتحقيق في تأثير المركبات الكيميائية، والبروتينات، والسموم، والبكتيريا، أو المسابير المشتقة من المريض على سلامة الحاجز المعوي.
Introduction
يتم الحفاظ على سلامة الحاجز الظهاري من قبل مجمع تقاطع apical (AJC) ، والتي تتكون من تقاطع ضيق (TJ) وتقاطع الالتزام (AJ) البروتينات1. الهيكل الاستقطابي للAJC أمر حاسم لوظيفته في الجسم الحي. Dysregulation من AJC موجود في مختلف الأمراض ويشتبه في أن يكون محفزا هاما لمسببات التهاب الأمعاء. فقدان وظيفة الحاجز المعوي يمثل الحدث الذي بدأ المرض. نقل التالية من البكتيريا commensal والاستجابات الالتهابية هي العواقب المؤلمة2.
وقد وضعت مختلف في المختبر وفي نماذج على نطاق الكاف للتحقيق في تنظيم AJC. ويستند ازى ترانسويل على أحادية الخلية ثنائية الأبعاد (2D) التي تم اشتقاقها من خطوط الخلايا السرطانية. هذه النظم جيدة للتقييم بالطرق البصرية والبيوكيميائية وتمكين تحليل العديد من العينات في نفس الوقت ولكنتفتقر إلى العديد من ميزات الخلايا الأولية وعمليات التمايز الموجودة في الجسمالحي. التحقيق في سلامة الحاجز ممكن أيضا في النماذج الحيوانية. في التجارب النهائية ، يمكن قياس آثار علاجات محددة في الجسم الحي على نفاذية الأمعاء بأكملها. ومع ذلك ، تتطلب هذه النماذج عددًا كبيرًا من الحيوانات ، ولا تسمح بتصور مفصل للعمليات الجزيئية الأساسية. في الوقت الحاضر تحسين 3D في نماذج المختبر متوفرة أن تلخيص عمليات التمايز الخلية عن كثب، والاستقطاب الخلية، وتمثل بنية سرداب فيلوس من الأمعاء3. يتطلب تطبيق الأعضاء المعوية ثلاثية الأبعاد للتحليلات الوظيفية تكييف الأساليب المتاحة من النماذج 2D. هنا نصف نموذج للتحقيق في سلامة الحاجز المعوي في الكائنات الحية الصغيرة الماوس المعوي. تم إنشاء الفحص للتحقيق في تأثير IFN-ο على سلامة الحاجز وبروتينات التقاطع الضيقة المعنية8.
على النقيض من تقنية تطبيقها ليزلي4، زيتيك5، أو بيرس6، الذي يقيس الفلورسينس بعد إزالة لوسيفر الأصفر (LY) من المتوسط ، نهجنا يسمح قياس كمية من التراكم المضيئ ة للفلوروفور مع مرور الوقت. لذلك ، تمثل النتيجة حركية ديناميكية للأخذ ويمكننا من القول تطبيق محفزات أو مثبطات إضافية أثناء التجربة. حقيقة أن كلا المقاييس قياس الزيادة من الجانب الباسوري الخارجي إلى السطح apical داخل في تناقض واضح مع الوضع في الجسم الحي. وفي نموذج وصفه هيل وآخرون7،تم استكشاف هذا الموضوع. عند الحقن المجهري للفلوروفور في تجويف الجهاز ، تم قياس الفلورسينس. يمثل اتجاه الانتشار الاتجاه الموجود في الجسم الحي. الجهد التقني للحقن المجهري يقلل بوضوح من إنتاجية هذه الطريقة. وعلى النقيض من النموذج الموصوف هنا، فإن طريقة الحقن المجهري تمكن من قياس الآثار التي تتطلب التنشيط البيولوجي على السطح الظهاري apical.
ويستند نموذج سلامة الحاجز المنهي المعروض هنا على المجهر الحي للخلايا ويمكّن من تحليل التغيرات الديناميكية داخل لائحة AJC بمرور الوقت. يمكن تطبيق الإعداد لاختبار التأثير الدوائي للمواد المسببة وتثبيط سلامة الحاجز المعوي. وعلاوة على ذلك، تساعد النماذج القائمة على الأنرجوية على تقليل عدد الحيوانات المستخدمة في الدراسات الدوائية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا القول يقدم تقنية لدراسة سلامة الحاجز المعوي داخل الأعضاء الحية. ويستند الفحص كله على الأعضاء الماوس المعوية الصغيرة والمجهر الخلية الحية confocal. لذلك ، من الإلزامي ممارسة المناولة السليمة للعضويات مسبقًا. عند العزلة ، يمكن تقسيم organoids بشكل روتيني وتخزينها عن طريق التجميد البارد3،9. لهذا القول نوصي تقسيم organoids 48 ساعة قبل أن يبدأ العلاج. هذه الفترة يعطي organoids فرصة لإغلاق تماما وتشكيل هياكل كروية. البذر من organoids للتجربة هو خطوة حاسمة داخل المنازب. لتقليل اختلافات المناولة الفردية، نوصي بإجراء روتيني لعملية البذر. هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية، وبروتوكول معالجة روتينييقلل بوضوح من الاختلافات التجريبية.
أثناء إجراء البذر (الخطوة 1.7) تتفتت الأجزاء المنزرعة عن طريق التمرير المتكرر من خلال طرف ماصة 10 ميكرولتر قياسي. حجم المسام من هذا المنتج يختلف من شركة إلى أخرى. يجب أن يتم ممارسة هذا الإجراء مسبقاً، وينبغي دائماً التحقق من النتيجة عن طريق المجهر على النقيض من المرحلة. بمجرد أن تصل الأعضاء التي تم الحصول عليها إلى الحجم المطلوب ، لا تغير الإجراء.
يجب تحسين البذر من organoids وتكييفها لإعداد المجهرية المتاحة. لتكون قادرة على الثقافة والصورة organoids لمدة لا تقل عن 48 ساعة ، مطلوب تماما غرفة المجهر المحتضن. اختر قسيمة تغطية غرفة تطابق متطلباتك. عند بذر الأورغيات، تأكد من تركيز الأعضاء على سطح الانزلاق. هذا ممكن عن طريق الحفاظ على غطاء غرفة على حزمة الجليد لمدة 5 دقيقة بعد وضع خلية مصفوفة الجهازية تعليق. هذه الخطوة مهمة لزيادة جودة التصوير بالخلايا الحية. دقة محورية ومسافة العمل من عدسات المجهر البؤري محدودة بشكل خاص. كلما اقتربت من إحضار العينة إلى العدسة ، كلما كان بإمكانك صورتها بشكل أفضل ، وهناك حاجة إلى طاقة ليزر أقل لإثارة الفلورسينس LY.
Phototaxis هي قضية هامة عندما يتعلق الأمر المجهري الخلية الحية. ضمن هذا القول نستبعد هذا الخيار. AJC وظيفية مرئية عن طريق استبعاد LY من تجويف الجهاز(الشكل 1، PBS). إضافة EGTA في نهاية التجربة يسبب عزل الأيونات bivalent، والتي هي العوامل المشتركة لبروتينات AJC. يتم استبعاد LY من تجويف الجهاز فقط في الأعضاء الحيوية مع مجمع AJC وظيفية. بشكل عام ، يمكن استخدام جزيئات الفلورسنت لقياس سلامة الحاجز المعوي. اخترنا LY بدلا من الفلوروفوريات الأخرى المستخدمة عادة مثل الفلورسيسين المسمى dextran لأن تلك يتم نقلها عبر الخلايا في الخلايا المعوية من القاعدية إلى المقصورة apical9. اخترنا أيضا LY بسبب صغر حجمها. LY لديه وزن جزيئي من 457 دا، وبالتالي يسهل التحقيق في نفاذية الحاجز للجزيئات الصغيرة. جزيء الفلورسنت يجب أن يتم اختياره اعتمادا على السؤال العلمي الذي تم التحقيق فيه. نظرًا لوجود عيوب AJC السامة للضوء ، يجب تقليل طاقة الإثارة بالليزر أو تمديد فترة التصوير. تقنية التصوير المحوري الأمثل لهذا الفحص هو تدوير المجهر القرص. تمكن الأدوات ذات الصلة التصوير البؤري مع وقت تعرض قصير عند طاقة الليزر المنخفضة.
وقد وضعت بالفعل نماذج مختلفة لدراسة سلامة الحاجز المعوي في المختبر. في حين أن استخدام المقالات على أساس monolayers خط الخلية أو التجارب في الجسم الحي آخذة في الانخفاض، وزيادة الأساليب القائمة على الجهاز. على النقيض من الأساليب الموصوفة سابقا4،5،6،7، لدينا طريقة تسمح تحديد حجم وظيفة الحاجز مع مرور الوقت. وهذا يسمح بالتعرض للمنبهات الإضافية على مدار التجربة. هنا نطبق EGTA كحافز ثان في نهاية التجربة كتحكم إيجابي.
على النقيض من الوضع في الجسم الحي، في لدينا مقدرة LY يضاف إلى الوسط ويخترق الجهازية من الجانب الظهاري basolateral خارج نحو تجويف apical داخل. وLY صغيرة ويستخدم فقط لتصور ضيق الحاجز المعوي. الجزيئات والمحفزات التي تعدل الطبقة الظهارية على سطح apical تحتاج إلى حقنها في تجويف الجهاز ية7. للحد من الجهد التجريبي ولتكون قادرة على قياس سلامة الحاجز من العديد من organoids في نفس الوقت، اخترنا لتطبيق صبغة الفلورسنت من الخارج.
استخدمنا القول للتحقيق في وظيفة IFN-ο على تقاطع ضيق من organoids الماوس المعوية الصغيرة. حقيقة أننا تمكنا من تحليل سلامة الحاجز في الأعضاء الحية يوفر إمكانيات مستقبلية لتطبيق هذه التقنية لوصف مثبطات للانهيار الناجم عن الالتهاب للحاجز المعوي. المواد التي تتصدى لوظيفة الحاجز الضعيف الناجمة عن IFN-ο يمكن أن تكون مرشحة لعلاج أمراض الأمعاء الالتهابية ، حيث تكون وظيفة الحاجز الضعيف واحدة من العوامل المسببة للأمراض10.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الألمانية للبحوث [KFO257(، ومشروع 4 إلى M.S. و المشروع من 1 إلى C.B.; FOR2438، المشروع 2 إلى M.S. و E.N. والمشروع 5 إلى C.B. مشروع SFB1181 C05 إلى C.B.; TRR241، المشروع A06 إلى N.B.L. و M.S.، المشروع A03 إلى C.B.، BR5196/2-1 إلى N.B.L. و BE3686/2 إلى C.B.]؛ مركز متعدد التخصصات للبحوث السريرية (IZKF) من المركز السريري إرلانغن (إلى M.S. ، E.N. ، وM.B.) ، وW. Lutz Stiftung (إلى M.S.) وForschungsstiftung Medizin من المركز السريري إرلانجن (إلى M.S. ). تم تنفيذ هذا العمل في (جزئي) الوفاء بمتطلبات الحصول على درجة الدكتور ميد من ماركو باردينباخر.
Materials
| 48-well culture plate | Thermo Fisher Scientific | #150687 | |
| 8-well chamber slides | Ibidi | #80826 | |
| 96-well culture plate | Greiner Bio-One | #655101 | |
| Axio Observer.Z1 – spinning disc | Zeiss | excitation laser 488 nm / emission filter 525/25 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Centrifugation tube 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 11507411 | |
| Centrifugation tube 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 10788561 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788-25g | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 431788 | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
| Matrigel, growth factor reduced, phenol red free | Corning | 356231 | Cell matrix solution |
| Mice | The Jackson Laboratory | M. musculus C57/Bl6 | |
| Microscope coverslip | 24×60 mm | ||
| Organoid Growth Medium mouse | Stemcell Technologies | #06005 | |
| Phosphate buffered saline | Biochrom | L182-05 | |
| Recombinant murine IFN-γ | Biolegend | Cat#575304 |
References
- López-Posadas, R., Stürzl, M., Atreya, I., Neurath, M. F., Britzen-Laurent, N. Interplay of GTPases and Cytoskeleton in Cellular Barrier Defects during Gut Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1240 (2017).
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infection and Immunity. 83 (1), 138-145 (2015).
- Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion. Scientific Reports. 5 (1), 16831 (2015).
- Pearce, S. C., et al. Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types. BMC Biology. 16 (1), 19 (2018).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
- Tomita, M., Hotta, Y., Ohkubo, R., Awazu, S. Polarized transport was observed not in hydrophilic compounds but in dextran in Caco-2 cell monolayers. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (3), 330-331 (1999).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
