Untersuchung des Darmbarriereabbaus bei lebenden Organoiden
Summary
Hier beschreiben wir eine Technik zur Quantifizierung der Barriereintegrität kleiner Darmorganoide. Die Tatsache, dass die Methode auf lebenden Organoiden basiert, ermöglicht die sequenzielle Untersuchung verschiedener Barriereintegritätsmodulisierungssubstanzen oder Kombinationen davon in einer zeitaufgelösten Weise.
Abstract
Organoide und dreidimensionale (3D) Zellkulturen ermöglichen die Untersuchung komplexer biologischer Mechanismen und Vorschriften in vitro, was in klassischen Zellkultur-Monolayern bisher nicht möglich war. Darüber hinaus sind monolayer Zellkulturen gute In-vitro-Modellsysteme, stellen aber nicht die komplexen zellulären Differenzierungsprozesse und -funktionen dar, die auf 3D-Strukturbasieren. Dies war bisher nur in Tierversuchen möglich, die mühsam, zeitaufwändig und mit optischen Techniken schwer einzuschätzen sind. Hier beschreiben wir einen Assay, um die Barriereintegrität im Laufe der Zeit bei lebenden kleinen Darm-Mausorganoiden quantitativ zu bestimmen. Um unser Modell zu validieren, haben wir Interferon-Gamma (IFN-) als positive Kontrolle zur Barrierezerstörung und Organoide, die von IFN-Rezeptor 2 abgeleitet wurden, Mäuse als Negativkontrolle ausschalten. Der Test ermöglichte es uns, die Auswirkungen von IFN-A auf die Darmbarriereintegrität und den IFN-induzierten Abbau der engen Knotenproteine Claudin-2, -7 und -15 zu bestimmen. Dieser Test könnte auch verwendet werden, um die Auswirkungen von chemischen Verbindungen, Proteinen, Toxinen, Bakterien oder patientenabgeleiteten Sonden auf die Integrität der Darmbarriere zu untersuchen.
Introduction
Die Integrität der Epithelbarriere wird durch den apikalen Kreuzungskomplex (AJC) aufrechterhalten, der aus engen Kreuzungen (TJ) und Adhärenjunction (AJ) Proteinenbesteht 1. Die polarisierte Struktur des AJC ist entscheidend für seine Funktion in vivo. Dysregulation der AJC ist bei verschiedenen Krankheiten vorhanden und wird vermutet, ein wichtiger Auslöser der entzündlichen Darmpathogenese zu sein. Der Verlust der Darmbarrierefunktion stellt das anregungs Ereignis der Krankheit dar. Die folgende Translokation von Kommensalen und Entzündungsreaktionen sind die schmerzhaften Folgen2.
Zur Untersuchung der Regulierung des AJC wurden verschiedene In-vitro- und In-vivo-Modelleentwickelt. Der Transwell-Assay basiert auf zweidimensionalen (2D) Zellmonolayern, die aus Tumorzelllinien abgeleitet wurden. Diese Systeme sind gut zu bewerten mit optischen und biochemischen Methoden und ermöglichen die Analyse vieler Proben gleichzeitig, aber es fehlen viele Merkmale der Primärzellen und der Differenzierungsprozesse in vivo. Die Untersuchung der Barriereintegrität ist auch in Tiermodellen möglich. In terminalen Experimenten können die Auswirkungen spezifischer Behandlungen in vivo auf die Durchlässigkeit des gesamten Darms quantifiziert werden. Diese Modelle erfordern jedoch eine große Anzahl von Tieren, und sie erlauben keine detaillierte Visualisierung der zugrunde liegenden molekularen Prozesse. Heutzutage sind verbesserte 3D-In-vitro-Modelle verfügbar, die Zelldifferenzierungsprozesse, Zellpolarisation und die kryptisch-villus Struktur des Darms3darstellen. Die Anwendung von 3D-Darmorganoiden für funktionelle Analysen erfordert die Anpassung der verfügbaren Methoden aus 2D-Modellen. Hier beschreiben wir ein Modell zur Untersuchung der Integrität der Darmbarriere bei lebenden kleinen Darmmausorganoiden. Der Assay wurde eingerichtet, um die Wirkung von IFN-A auf die Barriereintegrität und die jeweiligen engen Knotenproteine8zu untersuchen.
Im Gegensatz zu der von Leslie4, Zietek5oder Pearce6angewandten Technik, die die Fluoreszenz misst, nachdem luzifergelb (LY) aus dem Medium entfernt wurde, ermöglicht unser Ansatz die Quantifizierung der luminalen Aufnahme des Fluorophors im Laufe der Zeit. Daher stellt das Ergebnis eine dynamische Aufnahmekinetik dar und unser Assay ermöglicht die Anwendung zusätzlicher Reize oder Inhibitoren während des Experiments. Die Tatsache, dass beide Assays die Aufnahme von der äußeren basolateralen Seite zur inneren apikalen Oberfläche messen, steht in klarem Gegensatz zur Situation in vivo. In einem von Hill et al.7beschriebenen Modell wurde dieses Thema untersucht. Bei der Mikroinjektion des Fluorophors in das Lumen des Organoids wurde die Fluoreszenz quantifiziert. Die Diffusionsrichtung stellt die in vivo vorliegende Richtung dar. Der technische Aufwand der Mikroinjektion reduziert den Durchsatz dieser Methode deutlich. Im Gegensatz zu dem hier beschriebenen Modell ermöglicht das Mikroinjektionsverfahren die Messung von Effekten, die eine biologische Aktivierung auf der apikalen Epitheloberfläche erfordern.
Das hier vorgestellte Organoid-Barriereintegritätsmodell basiert auf der Live-Zellmikroskopie und ermöglicht die Analyse dynamischer Veränderungen innerhalb der AJC-Regelung im Laufe der Zeit. Das Setup kann angewendet werden, um die pharmakologischen Auswirkungen von Substanzen zu testen, die die Integrität der Darmbarriere induzieren und hemmen. Darüber hinaus tragen organoidbasierte Modelle dazu bei, die Anzahl der Tiere zu reduzieren, die für pharmakologische Studien verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Test bietet eine Technik, um die Darmbarriere Integrität in lebenden Organoiden zu studieren. Der gesamte Assay basiert auf kleinen Darm-Mausorganoiden und konfokaler Lebendzellmikroskopie. Daher ist es obligatorisch, den richtigen Umgang mit Organoiden im Voraus zu üben. Bei Isolation können Organoide routinemäßig geteilt und durch Kryofreezing gespeichert werden3,9. Für diesen Test empfehlen wir, die Organoide 48 h vor Beginn der Behandlung zu spalten. Diese Periode gibt den Organoiden die Möglichkeit, sich völlig zu schließen und sphärische Strukturen zu bilden. Die Aussaat der Organoide für das Experiment ist ein kritischer Schritt innerhalb des Assays. Um individuelle Handhabungsvarianten zu reduzieren, empfehlen wir ein Routineverfahren für den Aussaatprozess. Dieser Schritt ist entscheidend, und ein routinemäßiges Handling-Protokoll reduziert experimentelle Variationen deutlich.
Während des Aussaatvorgangs (Schritt 1.7) werden die Organoide durch wiederholtes Passieren durch eine Standard-Pipettespitze von 10 l fragmentiert. Die Porengröße dieses Produkts variiert von Unternehmen zu Unternehmen. Dieses Verfahren sollte im Voraus geübt werden, und das Ergebnis sollte immer durch Phasenkontrastmikroskopie überprüft werden. Sobald die erhaltenen Organoide die gewünschte Größe erreichen, ändern Sie das Verfahren nicht.
Die Aussaat der Organoide muss optimiert und an das verfügbare mikroskopische Setup angepasst werden. Um Organoide mindestens 48 h kulturieren und abbilden zu können, ist eine inkubierte Mikroskopkammer unbedingt erforderlich. Wählen Sie einen kammerierten Coverslip, der Ihren Anforderungen entspricht. Achten Sie bei der Aussaat der Organoide darauf, die Organoide auf die deckförmige Oberfläche zu konzentrieren. Dies ist möglich, indem der kammerförmige Coverslip für 5 min nach dem Platzieren der Zellmatrix-Organoidsuspension auf einer Eispackung gehalten wird. Dieser Schritt ist wichtig, um die Qualität der konfokalen Live-Zell-Bildgebung zu erhöhen. Die axiale Auflösung und der Arbeitsabstand von konfokalen Mikroskoplinsen sind besonders begrenzt. Je näher Sie die Probe zur Linse bringen, desto besser können Sie sie abbilden und desto weniger Laserenergie wird benötigt, um die LY-Fluoreszenz zu erregen.
Phototaxis ist ein wichtiges Thema, wenn es um die Lebende Zellmikroskopie geht. Innerhalb dieses Assays schließen wir diese Option aus. Ein funktioneller AJC ist sichtbar, indem LY aus dem Lumen des Organoids ausgeschlossen wird (Abbildung 1, PBS). Die Zugabe von EGTA am Ende des Experiments bewirkt die Sequestrierung bivalenter Ionen, die Kofaktoren für AJC-Proteine sind. LY ist vom Lumen des Organoids nur bei lebenswichtigen Organoiden mit einem funktionellen AJC-Komplex ausgeschlossen. Im Allgemeinen können fluoreszierende Moleküle verwendet werden, um die Integrität der Darmbarriere zu messen. Wir haben uns für LY anstelle anderer gebräuchlich erwählter Fluorophore wie Fluorescein mit Dextran, da diese transzellular in Darmzellen vom Basal in das apikale Fach9transportiert werden. Wir haben uns auch für LY aufgrund seiner geringen Größe entschieden. LY hat ein Molekulargewicht von 457 Da und erleichtert somit die Untersuchung der Barrieredurchlässigkeit für kleine Moleküle. Das fluoreszierende Molekül muss je nach untersuchter wissenschaftlicher Frage ausgewählt werden. Da phototoxische AJC-Defekte vorhanden sind, muss die Laseranregungsenergie reduziert oder das Bildgebungsintervall verlängert werden. Die optimale konfokale Bildgebungstechnik für diesen Test ist die Spinnbandmikroskopie. Entsprechende Instrumente ermöglichen konfokale Bildgebung mit kurzer Belichtungszeit bei geringer Laserleistung.
Verschiedene Modelle wurden bereits entwickelt, um die Integrität der Darmbarriere in vitro zu untersuchen. Während die Verwendung von Assays auf Basis von Zelllinien-Monolayern oder Experimenten in vivo abnimmt, nehmen organoidbasierte Methoden zu. Im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen Methoden4,5,6,7ermöglicht unsere Methode die Quantifizierung der Barrierefunktion im Zeitverlauf. Dies ermöglicht die Exposition der Organoide zu zusätzlichen Reizen im Laufe des Experiments. Hier wenden wir EGTA als zweiten Stimulus am Ende des Experiments als positivan.
Im Gegensatz zur Situation invivo wird in unserem Test LY in das Medium aufgenommen und dringt von der äußeren basolateralen Epithelseite in das innere apikale Lumen ein. Die LY ist klein und wird nur verwendet, um die Dichtheit der Darmbarriere zu visualisieren. Moleküle und Reize, die die Epithelschicht an der apikalen Oberfläche modulieren, müssen in dasLumendes Organoids 7 injiziert werden. Um den experimentellen Aufwand zu reduzieren und gleichzeitig die Barriereintegrität vieler Organoide messen zu können, haben wir uns dafür entschieden, den Fluoreszenzfarbstoff von außen anzuwenden.
Wir verwendeten den Assay, um die Funktion von IFN-A an der engen Kreuzung kleiner Darm-Maus-Organoide zu untersuchen. Die Tatsache, dass wir die Barriereintegrität bei lebenden Organoiden analysieren konnten, bietet zukünftige Möglichkeiten, diese Technik anzuwenden, um Inhibitoren für den entzündungsinduzierten Abbau der Darmbarriere zu beschreiben. Stoffe, die der durch IFN-A verursachten eingeschränkten Barrierefunktion entgegenwirken, könnten Kandidaten für die Behandlung entzündlicher Darmerkrankungen sein, bei denen eine eingeschränkte Barrierefunktion einer der pathogenen Faktoren ist10.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) [KFO257, Projekt 4 bis M.S. und Projekt 1 bis C.B. unterstützt; FOR2438, Projekt 2 bis M.S. und E.N. und Projekt 5 bis C.B.; SFB1181 Projekt C05 bis C.B.; TRR241, Projekt A06 bis N.B.L. und M.S., Projekt A03 zu C.B., BR5196/2-1 bis N.B.L. und BE3686/2 bis C.B.]; das Interdisziplinäre Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) des Klinischen Zentrums Erlangen (nach M.S., E.N. und M.B.), die W. Lutz Stiftung (zu M.S.) und die Forschungsstiftung Medizin des Klinischen Zentrums Erlangen (zu M.S.). Die vorliegende Arbeit erfolgte in (teilweiser) Erfüllung der Voraussetzungen für den Abschluss Dr. Med. von Marco Bardenbacher.
Materials
| 48-well culture plate | Thermo Fisher Scientific | #150687 | |
| 8-well chamber slides | Ibidi | #80826 | |
| 96-well culture plate | Greiner Bio-One | #655101 | |
| Axio Observer.Z1 – spinning disc | Zeiss | excitation laser 488 nm / emission filter 525/25 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Centrifugation tube 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 11507411 | |
| Centrifugation tube 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 10788561 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788-25g | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 431788 | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
| Matrigel, growth factor reduced, phenol red free | Corning | 356231 | Cell matrix solution |
| Mice | The Jackson Laboratory | M. musculus C57/Bl6 | |
| Microscope coverslip | 24×60 mm | ||
| Organoid Growth Medium mouse | Stemcell Technologies | #06005 | |
| Phosphate buffered saline | Biochrom | L182-05 | |
| Recombinant murine IFN-γ | Biolegend | Cat#575304 |
References
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