חקירת פירוק מחסום המעיים באורגנואידים חיים

כל השלבים הושלמו בהתאם ובציות לכל ההנחיות הרלוונטיות לטיפול בבעלי חיים מוסדיים. 1. ציפוי אורגנואידים לבודד אורגנואידים כמתואר בעבר3. ההליך מתואר בקצרה להלן. לאסוף את המעי הקטן מעכברים. פתח את המעי הקטן longitudinally ולהסיר טיפים villi ידי גירוד את רקמת המעי הפנימי עם שמיכות. חותכים את רקמת המעי בחתיכות קטנות באמצעות מספריים. רוחצים את החתיכות 5x בתמיסת מלח באגירה קרה (PBS) על ידי ליטוף החלקים 10x למעלה ולמטה עם פיפטה 25 מ ל. מודטת את חתיכות הרקמה בתמיסה 2 mM EDTA בקרח במשך 30 דקות על פלטפורמת טלטול אופקי. לאפשר את חתיכות הרקמה למשקעים. החלף את פתרון ה-EDTA עם מאגר PBS ברגע שחתיכות הרקמה מתפשרים בתחתית. השמט את הסופרנטאנט והוסף 20 מ ל של PBS. שחררו את קריפפי המעי מהרקמה על-ידי פיליטוף במרץ 10x למעלה ולמטה באמצעות מפית של 10 מ ל. לאסוף את supernatant ב צנטריפוגה צינורות ולבדוק את זה על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. כדי לעשות זאת, להוסיף טיפה של supernatant ללוח 96 היטב של תרבות התא. . שמרו על צנטריפוגה צינורות בקרח חזור על שלבים 1.1.6 – ה1.1.8 עד למספר הקריפטטים של המעי-שננט שנאסף. להעביר את השברים המכילים את הקריפטטים ביותר באמצעות מסננת תא 70 יקרומטר. צנטריפוגה את ההשעיה קריפטה ב 300 x g, 4 ° צ’ עבור 5 דקות. השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה ב-PBS הקרה כדי לשטוף את הקריפטטים. לאחר מכן חזור על השלב הצנטריפוגה כפי שמתואר ב1.1.11. להשעות את הגלולה בסכום כולל של 25 μL לכל טוב של 1:1 תערובת של פתרון מטריצה התא ובינוניות התרבות מוראיד בינונית ולוחית של האורגנואידים בלוחות התרבות התאים 48. מודטה את האורגנואידים ב 37 ° c, 5% CO2, עבור 20 דקות כדי לאפשר פתרון מטריקס התא כדי לגבש. לכסות את האורגנואידים עם 300 μL של מדיום אורגנואיד מוראיד לכל טוב. תרבות האורגנואידים ב-37 ° c, 5% CO2, שינוי המדיום כל 2 – 3 ימים. השתמש באורגנואידים לניסויים לאחר 7 ימי תרבות. הכן את האורגנואידים. למדידת שלמות המכשול Precoat עיל כל צינורות צנטריפוגה שישמשו לאחסון האורגנואידים במהלך תהליך הציפוי עם אלבומין סרום השור (BSA) על ידי הוספת מספיק של 0.1% BSA הפתרון ב-PBS לכסות את כל משטחי הפלסטיק. ואז להסיר את הפתרון BSA שוב ולאחסן את הצינורות צנטריפוגה על הקרח. הפשרת הפתרון של מטריצת התאים ובינוניות של תרבות ארגונית על הקרח. כדי להפריד את האורגנואידים, להסיר בזהירות את בינונית התרבות ולהשעות מחדש את האורגנואידים מבאר אחת של 48 צלחת הבאר ב-1 מ ל של הקרה PBS. מתמוסס את מטריצת התא על ידי ליטוף נמרץ. תמיד לשמור על ההשעיה אורגאיד ב צנטריפוגה צינורות מראש עם BSA ותמיד לשמור על קרח.הערה: צפיפות, גודל, ומיקום של האורגנואידים בתוך שקופית שמיכות השינה מושפעים יחס מפוצל, ריכוז פתרון מטריצה התא, וטיפול של השעיית מטריצה התא האורגאידית. מומלץ לתרגל את הטיפול בפתרון מטריצת התא מראש. בדרך כלל שמונה שמיכות זכוכית היטב מתאימים את הצורך. אורגנואידים נגזר מבאר אחת של confluent 48 צלחת הבאר ניתן לפצל לשתי בארות של שמונה שמיכות היטב שחור (40 μL של מטריצה תא מטריקס-cell לכל טוב). צנטריפוגה את ההשעיה אורגאיד ב 300 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות. והשהה מחדש את הגלולה. עם 1 מ ג של הצטננות צנטריפוגה את ההשעיה אורגאיד ב 300 x g, 4 ° צ’ עבור 5 דקות. להיפטר supernatant לחלוטין ולהשעות מחדש את האורגנואידים נגזר מבאר אחת מ 48 צלחת הבאר ב 40 μL של בינוני קר. קטע של מבנים אורגנואיד גדולים על ידי ליטוף ההשעיה ארגונית 5x דרך 10 μl לדקה עצה כדי לאסוף מבנים עם גודל של 40 – 60 יקרומטר עבור זריעה.הערה: השתמש בטיפ 10 μL בעצת פיפטה 100 μL עבור הפיצול של המבנים האורגאידים, והתרגול שלב 1.7 מראש כדי להבטיח תוצאות עקביות. שלוט בגודל האורגנואידים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה בתוך צינור הצנטריפוגה. ודא כי אין יותר אורגנואידים מרובים בהווה וכי שברי האורגנואיד הם בערך 40 – 60 יקרומטר ארוך. לאחר האורגנואידים השיגו את הגודל הרצוי, לערבב אותם עם 40 μL של פתרון מטריצה התא (בינוני: פתרון מטריצה התא = 1:1).הערה: יש לשמור על יחס הפתרון הבינוני לתאי המטריצה באופן קבוע כדי להשיג תוצאות עקביות. דילול הפתרון של מטריצת התא מפחית את הנוקשות של כתם אורגאיד ומשפיע על תכונות הדיפוזיה שלה. השתמשו בטיפים מצוננים לחיות מחמד (-20 ° c) לכל השעיות המכילות פתרון מטריצת תאים. מקום 40 μL של פתרון מטריצת התא של אורגנואיד-תא הבולם במרכז של כל באר של 8 שמיכות היטב. שמור את השקופית על חבילת קרח עבור 5 דקות. הדבר משמר את הנוזל הבולם הפנימי של מטריצת התאים ומגביר את הריכוז האורגאיד במשטח הכיסויים על ידי כוח הכבידה. מודטה עבור 20 דקות ב 37 ° צ’ ו 5% CO2 כדי לאפשר פולימור של בועה מטריצה התא ארגונית. הוסף 150 μL של בינוני תרבות אורגנואיד לטוב ומארג עבור 24 שעות ב 37 ° צ’ ו 5% CO2 לפני שתמשיך בטיפול ניסיוני. השתמש בתקופה זו כדי לטפל באורגנואידים ולווסת את שלמות המכשול בהתאם להשערה המדעית המתאימה. עבור שליטה חיובית, לטפל באורגנואידים עבור 48 h עם IFN-γ על מנת לחקור את IFN-γ הקשורות השפלה הצומת הדוק וחדירות להגדיל. לעורר את השליטה החיובית עם 10 U/mL (10 ng/mL) רקומביננטי murine IFN-γ. השאר את האורגנואידים. של אחד שלא מטופל מארגני תרבות ב 37 ° צ’ ו 5% CO2 עד 48 h. 2. שיטת הפראואיפרביליות הביאו את חדר הדגירה של המיקרוסקופ ל-37 ° c לפחות 2 שעות לפני תחילת הניסוי כדי להפחית את הסחף התרמי תוך הדמיה של האורגנואידים. הכינו פתרון 100 מ”מ של LY ב-PBS. . החנות על הקרח מוגנת מהאור הכינו פתרון 200 מ”מ של EGTA ב-PBS. . לאחסן אותו על הקרח להעביר את שמיכות קאמרית כולל אורגנואידים לתוך החדר דגירה של מיקרוסקופ קונפוקלית וקד הפוך ולהפעיל את CO2 דגירה (5%). ודאו שהוא נעול היטב. בתוך הבמה של המיקרוסקופ שימוש באורגנואידים באחד היטב כהפניה, להתאים את הגדרות ההדמיה של המיקרוסקופ. הוסף LY (3 μL של 100 mM LY ב 150 μL של בינוני) כדי לקבל את הנפח הסופי של 1 mM LY ב 300 μL של בינוני. מודטה על המיקרוסקופ עבור 1 h ולהתאים את המוקד להדמיה של אורגנואידים לומן. הגדר את אנרגיית הלייזר הנדרשת עבור עירור LY (488 nm) ואת הרגישות לזיהוי בהתאמה של המכשיר ולנסות לצלם את הזריחה לולי ב 30-40% מהטווח הדינמי הזמין של המכשיר בשימוש.הערה: כוונן את האנרגיה עירור לייזר ויעילות זיהוי על אורגנואידים מטופל 70 דקות לאחר התוספת של LY. ודא כי האנרגיה עירור גבוהה מספיק כדי לקבל תמונה חשופה היטב. כדי למנוע רוויה של הקרינה הפלואורסצנטית בתוך התמונות המיקרוסקופית, מומלץ לכוונן הגדרות אלה לאחר שדיפוזיה LY מגיעה למצב קבוע. הגדר את מיקום האורגנואידים על-ידי הדמיה חיה של ניגוד הפרעות דיפרנציאלי (DIC). לנסות אורגנואידים התמונה עם קטרים דומים (80 ± 30 μm) ולהתמקד בפרוסה המרכזית של האורגנואידים לדמות לומן שלהם. להגדיר בערך 10 אורגנואידים בסדר ולנסות תמונה ארגונית בלבד קרוב משטח coverslip עם מבנה כדורי.הערה: מספר האורגנואידים הניתנים לדימות לכל הפעלה תלוי במהירות המיקרוסקופ. מומלץ לדמות את האורגנואידים בתוך מרווח של 5 דקות. על מיקרוסקופ רגיל סריקת לייזר, 40 מיקומים בסך הכל הם נקודת התחלה סבירה. הקלט את הזריחה הDIC ואת הקרינה הרגילה של כל תנוחה כדי לתעד את הצורה והקרינה האוטומטית של האורגנואיד לפני הוספת ה-LY לבארות, המשמשות לצורך שלמות המכשול. אין להציג את התמונות המוצגות באמצעות מיון אוטומטי גבוה. זה בשל הצטברות של תאים מתים בתוך לומן של אורגאיד, ואת התוצאות של מארגני פלורסנט אוטונואידים קשה לנתח לאחר מכן. לדלל 3 μL של הפתרון LY מוכן (100 mM LY ב 150 μL של בינוני) ולהוסיף את זה בזהירות לכל טוב מבלי לגעת הcoverslip שמיכות. הריכוז המומלץ של LY לטובה הוא 1 מ”מ. אמצעי האחסון הסופי צריך להיות 300 μL. בדוק במהירות את המיקוד של המיקומים המוגדרים ותקן במידת הצורך.הערה: מפזר במהירות דרך מטריצת התאים. לכן, הדמיה קונפוקלית וקד חייב להיות מופעל בתוך 3 דקות לאחר התוספת של fluorophore. התחל הדמיה של הזמן במיקרוסקופ. קח תמונה פלואורסצנטית של כל תנוחה כל 5 דקות עבור סך של 70 דקות.הערה: האורגנואידים היו מתמונות במרווחי זמן של 5 דקות כדי להמחיש את הספיגה של LY לאורך זמן. כדי למדוד את התמוטטות מחסום המעי, זה מספיק כדי להקליט את הזריחה לפני ו 60 דקות אחרי בתוספת LY ושוב 10 דקות לאחר התוספת של EGTA. הוסף 3 μL של הפתרון EGTA מוכן גם בלי לגעת הcoverslip שמיכות. הריכוז המומלץ בתוך שמיכות השינה של EGTA הוא 2 מ”מ. אמצעי האחסון הכולל בטוב צריך להיות 300 μL. . תתחיל לשגות בפעם השנייה הקלט את הזריחה של האורגנואידים המוגדרים שוב עם מרווח של 5 דקות עבור סך של 30 דקות. התעלם מהכל לפי תקנות הבטיחות המקומיות.הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. 3. ניתוח נתונים רק לנתח את התוצאות של האורגנואידים כי לקח LY לאחר התוספת EGTA. ניתן לכמת את התוצאות. עם הצילום של פיג’י קבוצת נתונים פתוחה ב-ImageJ על-ידי לחיצה על קובץ | פתיחה ובחירה של נתוני תמונה. בתיבת הדו הבאה של אפשרויות ייבוא-תבניות, בחר באפשרות הצגת מחסנית עם: Hyperstack. פתח את האזור של מנהל הריבית (ROI) על-ידי לחיצה על נתח | כלים | רועי מנהל. ציירו ROI אליפטי על ידי לחיצה על לחצן הבחירה האליפטית בשורת התפריטים imagej. ציירו בחירה המכילה את הלוומן הפנימית של האורגנואיד. לאחר מכן, לחץ על הוסף ב-ROI Manager. חזור על השלבים עבור שלושה אזורים מייצגים מחוץ לאורגנואיד. לחצו על ‘ נתח ‘ בשורת התפריטים ובחרו ‘ קבע מדידות’. הפעל ערך אפור ממוצע בלבד והשבת כל מדידה אחרת. לאחר מכן לחץ על אישור. ודא שכל ROIs נבחרו במנהל הROI. במנהל הROI, לחץ על עוד | ריבוי מידות. בתיבת הדו של האפשרות בחר מדידה של כל הפרוסות […] ושורה אחת לכל פרוסה. לאחר מכן לחץ על אישור. בחר את כל הערכים בחלון התוצאות והעתק אותם ליישום גיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף.הערה: אם מיקומו של האורגנואיד הוזז במהלך הדימות בזמן ההדמיה, יש לכוונן את ההחזר בהתאם. לשם כך, בחר את ההחזר הנכון במנהל הROI והעבר אותו למיקום החדש. לאחר מכן לחץ על עדכן במנהל הROI. בצע את המדידה עבור כל נקודת זמן בנפרד על-ידי לחיצה על מדידה במנהל הROI, ולאחר מכן עבור לנקודת הזמן הבאה בחלון התמונה באמצעות הסרגל בתחתית. אסוף את כל המדידות בגיליון אלקטרוני. הצורה הבודדת ותנועת האורגנואידים במהלך תקופת ההדמיה מחייבת ניתוח של הנתונים באופן ידני. לחשב את ערך העוצמה הממוצע של שלושת ROIs מחוץ לאורגנואיד עבור כל נקודת זמן. לחלק את עוצמת ההחזר של התשואה בתוך לומן של אורגאיד על ידי העוצמה הממוצע של הROI בחוץ ואת העוצמה ממוצע בתוך אורגאיד. כדי לחשב את העלייה היחסית של הקרינה הפלואורסצנטית אורגנואיד, לחלק את הזריחה היחסית (ראה שלב 3.11) בכל נקודת זמן התמונה על ידי הזריחה היחסית מינימלית.הערה: השתמש בזריחה היחסית המינימלית, כי לפעמים הדיפוזיה של הפלואורוורידים יכולה להיות איטית בתחילת הניסוי.