生きているオルガノイドにおける腸のバリア破壊の調査

すべてのステップは、関連するすべての規制および制度的動物ケアガイドラインに従って完了しました。 1. オルガノイドのめっき 前述のオルガノイドを分離する 3.手順は以下に簡単に説明します。 マウスから小腸を収集します。 小腸を縦方向に開き、内側の腸組織をカバースリップで掻き取ることによって絨毛先端を取り除く。 はさみを使って小さくて腸組織を切ります。 25 mL ピペットで10倍上下にピペットを入れ、冷たいリン酸緩衝生理食塩分(PBS)で5倍洗浄します。 冷たい2 mM EDTA溶液を氷の上で、水平揺れプラットフォームで30分間インキュベートします。組織片を堆積物にします。 組織片が底部に落ち着いたら、EDTA溶液をPBSバッファーに交換します。上清を捨て、PBSを20mL加えます。 腸内窩を組織から10mLピペットで10倍上下に激しくピペット化して組織から放出する。 遠心管に上清を集め、位相差顕微鏡で検査します。これを行うには、上清の滴を96ウェル細胞培養プレートに加える。氷の上に遠心チューブを保管してください。 収集した上清の腸管の納骨堂の数が減少するまで、ステップ1.1.6~1.1.8を繰り返します。 最も多くの暗号を含む分数を70 μmの細胞ストレーナーに渡します。 300xgで、5分間4°Cgでクリプトサスペンションを遠心分離します。 上清を捨て、ペレットを冷たいPBSで再び懸濁させて、納骨堂を洗います。その後、1.1.11で説明したように遠心分離のステップを繰り返します。 細胞マトリックス溶液とマウスオルガノイド培養培地の1:1混合物のウェル当たり合計25μLのペレットを再懸濁し、48ウェル細胞培養プレートにオルガノイドをプレートします。 オルガノイドを37°C、5%CO2で20分間インキュベートし2、細胞マトリックス溶液を固化させます。 オルガノイドを300μLのマウスオルガノイド培地で覆います。 オルガノイドを37°C、5%CO22で培養し、2~3日ごとに培地を交換する。 培養7日後の実験にはオルガノイドを使用してください。 バリア完全性測定のためにオルガノイドを準備します。 すべてのプラスチック表面をカバーするためにPBSに0.1%BSA溶液を添加して、メッキプロセス中にオルガノイドをホッキプロセス中に保存するために使用されるすべての遠心チューブをPBSに追加してプレコートします。その後、もう一度BSA溶液を取り出し、氷の上に遠心チューブを保管します。 細胞マトリックス溶液およびオルガノイド培養液を氷上で解凍する。 オルガノイドを分離するには、慎重に培養培地を除去し、冷たいPBSの1mLで48ウェルプレートの1つのウェルからオルガノイドを再懸濁する。激しいピペット処理により細胞マトリックスを溶解します。BSAでコーティングされた遠心チューブにオルガノイド懸濁液を常に保管し、常に氷の上に保管してください。注:チャンバーカバースリップスライド内のオルガノイドの密度、サイズ、位置は、分割比、細胞マトリックス溶液濃度、およびオルガノイド細胞マトリックス懸濁液の取り扱いによって影響を受ける。セルマトリックス溶液の取り扱いを事前に実践することをお勧めします。通常、8つのよくチャンバーガラスカバーリップは、アッセイに適しています。コンフルエント48ウェルプレートの1つのウェルから誘導されるオルガノイドは、8つのウェルチャンバーカバースリップ(オルガノイド細胞マトリックスペレットの40 μLあたりウェル)の2つのウェルに分割することができます。 オルガノイド懸濁液を4°Cで300xgで5分間遠心する。 g 慎重に上清を捨て、冷たいPBSの1 mLでペレットを再懸濁します。 オルガノイド懸濁液を300xg、4°Cで5分間遠心分離する。 g 上清を完全に捨て、48ウェルプレートから得られたオルガノイドを40μLの冷媒で再懸濁します。大きなオルガノイド構造をフラグメント化し、オルガノイド懸濁液を10μLピペットチップを通して5xをピペット化し、播種用40~60μmの大きさの構造を収集します。注:オルガノイド構造の断片化には100 μLピペットチップの10μLチップを使用し、ステップ1.7を事前に実施して一貫した結果を確認します。遠心管内の位相コントラスト顕微鏡によりオルガノイドのサイズを制御します。これ以上多分岐オルガノイドが存在しなくて、オルガノイド断片の長さはおよそ40~60μmであることを確認してください。 オルガノイドが所望のサイズを得たら、細胞マトリックス溶液の40 μLと混合する(培地:細胞マトリックス溶液= 1:1)。注:一貫した結果を得るには、媒体とセルマトリックスの溶液比を一定に保つ必要があります。細胞マトリックス溶液の希釈は、オルガノイブブブブブの剛性を減少させ、拡散特性に影響を与えます。セルマトリックス溶液を含むすべての懸濁液に、あらかじめ冷却されたピペットチップ(-20°C)を使用してください。 オルガノイド細胞マトリックス溶液懸濁液の40 μLを、8ウェルチャンバーカバースリップの各ウェルの中央に配置します。 スライドをアイスパックに5分間置いておいて下さいます。これは細胞マトリックスオルガノイド懸濁液を維持し、重力によってカバースリップ表面でオルガノイド濃度を増加させる。 37°Cで20分間インキュベートし、5%CO2でインキュベートし、オルガノイド細胞マトリックスブロブの重合を可能にします。2 オルガノイド培地1ウェルあたり150μLを加え、実験処理を進める前に37°Cで24時間、CO2を5%インキュベートします。 オルガノイドを治療し、対応する科学的仮説に従ってバリアの完全性を調節するために、この期間を使用します。陽性対照のために、IFN-γ関連の緊密な接合の分解および透過性の増加を調査するためにIFN-γで48時間のオルガノイドを治療する。10 U/mL(10 ng/mL)組み換えマウスIFN-γで正のコントロールを刺激します。1つのオルガノイドをよく治療せずに残します。 培養オルガノイドは37°Cで、5%CO2で48時間まで培養した。2 2. オルガノイド透過性アッセイ 実験を開始する前に、少なくとも2時間で顕微鏡のインキュベーションチャンバーを37°Cに持ち込み、オルガノイドを撮影しながら熱ドリフトを低減します。 PBSでLYの100 mM溶液を調製します。光から保護された氷の上に保管してください。 PBSでEGTAの200 mM溶液を調製します。氷の上に保管してください。 オルガノイドを含むチャンバーカバースリップを反転した共焦点顕微鏡のインキュベーションチャンバーに移し、CO2インキュベーション(5%)をオンにします。チャンバーカバースリップが顕微鏡の段階内でしっかりとロックされていることを確認してください。 オルガノイドを参考にして、顕微鏡の撮像設定を調整します。LY(100 mM LYの3 μLを150 μLの培地で3μL)添加し、300 μLの培地で1mM LYの最終容積を得る。顕微鏡で1時間インキュベートし、オルガノイドの内腔のイメージングに焦点を合わせます。LY励起(488 nm)と各検出感度に必要なレーザーエネルギーを定義し、使用されている機器のダイナミックレンジの30~40%でLY蛍光を画像化します。注:LYを添加した後70分の未処理オルガノイドでレーザー励起エネルギーと検出効率を調整します。励起エネルギーが十分に露出した画像を得るのに十分な高さであることを確認します。顕微鏡画像内のLY蛍光の飽和を避けるために、LY拡散が定常状態に達した後にこれらの設定を調整することをお勧めします。 微分干渉コントラスト(DIC)ライブイメージングによりオルガノイドの位置を定義します。同等の直径(80±30μm)のオルガノイドを画像化し、オルガノイドの中央スライスに焦点を当ててルーメンをイメージします。ウェルあたり約10個のオルガノイドを定義し、カバースリップ表面に近いオルガノイドのみを球状構造で画像化しようとします。注:1回の走行で画像化できるオルガノイドの数は、顕微鏡の速度によって異なります。オルガノイドを5分間隔で画像化することをお勧めします。通常のレーザー顕微鏡では、合計で40の位置が合理的な出発点です。 障壁の完全性の調査のために使用される井戸にLYを加える前にオルガノイドの形および自己蛍光を文書化するためにあらゆる位置のDICおよびLYの蛍光を記録する。 高い自己蛍光を示すオルガノイドを画像化しないでください。これは、オルガノイドの内腔内の死んだ細胞の蓄積によるもので、その後の自己蛍光オルガノイドの結果を分析するのは困難です。 調製したLY溶液(100 mM LY中150 μLの培地)を3 μL希釈し、チャンバーカバースリップに触れることなく、これを各ウェルに慎重に加えます。井戸ごとのLYの推奨濃度は1 mMです。井戸あたりの最終ボリュームは300 μLである必要があります。 定義された位置のフォーカスを素早く確認し、必要に応じて修正します。注:LYはセルマトリックスを通して素早く拡散します。したがって、共焦点イメージングは、フルオロフォアの添加後3分以内に開始する必要があります。 顕微鏡でタイムラプスイメージングを開始します。5分ごとに全ての位置の蛍光像を、合計70分間撮ります。注:オルガノイドを5分間隔で画像化し、時間経過とともにLYの取り込みについて可視化した。腸バリア破壊を測定するには、LY添加後60分前後、EGTA添加後10分の蛍光を記録すればよい。 チャンバーカバースリップに触れることなく、準備されたEGTA溶液をウェルごとに3μL追加します。EGTAのチャンバーカバースリップ内の推奨濃度は2 mMです。ウェルあたりの総体積は300 μLである必要があります。 2 回目のタイムラプスを開始します。定義されたオルガノイドの蛍光を、合計30分間5分の間隔で再び記録します。 地域の安全規制に従ってすべてを廃棄します。注:プロトコルはここで一時停止することができます。 3. データ分析 EGTA添加後にLYを取り上げたオルガノイドの結果のみを分析する。 結果はフィジーの ImageJ で定量化できます。 [ファイル ] をクリックしてデータセットを ImageJで開く |画像データを開いて選択します。次の [BIO フォーマットインポート オプション] ダイアログで、[スタックの表示形式: ハイパースタック] を選択します。 [分析] をクリックして対象地域 (ROI) マネージャーを開きます。ツール|ROI マネージャー. ImageJ メニュー バーの[楕円] 選択ボタンをクリックして、楕円の ROI を描画します。オルガノイドの内腔を含む選択を描きます。次に、ROI マネージャで[追加] を押します。 オルガノイド以外の 3 つの代表的な領域に対して、この手順を繰り返します。 メニューバーの[分析]をクリックし、[計測値を設定]を選択します。[平均グレー値のみ]を有効にし、その他の測定を無効にします。次に、[OK]をクリックします。 ROI マネージャですべての ROI が選択されていることを確認します。ROI マネージャで、[その他] をクリックします。マルチメジャーオプションダイアログで、[すべての [..] スライスを測定し、スライスごとに 1 行を選択します。次に、[OK]をクリックします。 [結果]ウィンドウですべての値を選択し、さらに分析するためにスプレッドシート アプリケーションにコピーします。注:オルガノイドの位置がタイムラプスイメージング中に移動した場合、ROIはそれに応じて調整する必要があります。これを行うには、ROI マネージャで正しい ROI を選択し、新しい職位に移動します。次に、ROI マネージャで [更新] をクリックします。ROI マネージャで [計測] をクリックして各タイムポイントの計測を個別に実行し、下部のバーを使用してイメージ ウィンドウの次のタイムポイントに切り替えます。スプレッドシートにすべての測定値を収集します。イメージング期間中のオルガノイドの個々の形状と動きは、手動でデータを分析する必要があります。 各時間のオルガノイド外の3つのROIの平均強度値を計算します。 オルガノイドの内腔内のROIの強度を、外側のROIの平均強度とオルガノイド内の平均強度で割ります。 蛍光光の発光オルガノイドの相対的な増加を計算するために、最小の相対蛍光によって画像化された各時点での相対蛍光(ステップ3.11参照)を分割する。注:最小限の相対蛍光を使用して、時には、蛍光の拡散が実験の開始時に遅くなることがあるため。