Onderzoek naar darmbarrière afbraak in levende organoïden
Summary
Hier beschrijven we een techniek om de barrière-integriteit van kleine darmorganoïden te kwantificeren. Het feit dat de methode is gebaseerd op levende organoïden maakt het sequentiële onderzoek van verschillende barrière-integriteit modulerende stoffen of combinaties daarvan op een tijdopgeloste manier mogelijk.
Abstract
Organoïden en driedimensionale (3D) celculturen maken het mogelijk om complexe biologische mechanismen en voorschriften in vitro te onderzoeken, wat voorheen niet mogelijk was in de monolagen van de klassieke celkweek. Bovendien zijn monolayer celculturen goede in vitro modelsystemen, maar vertegenwoordigen ze niet de. complexe cellulaire differentiatieprocessen en -functies die afhankelijk zijn van 3D-structuur. Dit is tot nu toe alleen mogelijk geweest in dierproeven, die moeizaam, tijdrovend en moeilijk te beoordelen zijn door optische technieken. Hier beschrijven we een test om kwantitatief de barrière-integriteit in de loop van de tijd in levende kleine darmmuis organoïden te bepalen. Om ons model te valideren, hebben we interferon gamma (IFN-γ) toegepast als een positieve controle voor barrièrevernietiging en organoïden afgeleid van IFN-γ receptor 2 knock out muizen als een negatieve controle. De test stelde ons in staat om de impact van IFN-γ op de darmbarrière integriteit en de IFN-γ geïnduceerde afbraak van de strakke junction eiwitten claudin-2, -7 en -15 te bepalen. Deze test kan ook worden gebruikt om de impact van chemische verbindingen, eiwitten, toxines, bacteriën, of patiënt-afgeleide sondes op de darmbarrière integriteit te onderzoeken.
Introduction
Integriteit van de epitheliale barrière wordt gehandhaafd door het apicaljunctionalcomplex (AJC), dat bestaat uit strakke kruising (TJ) en hechtingskruising (AJ) eiwitten1. De gepolariseerde structuur van de AJC is cruciaal voor zijn functie in vivo. Dysregulatie van de AJC is aanwezig in verschillende ziekten en wordt vermoed dat een belangrijke trigger van inflammatoire darmpathogenese. Verlies van darmbarrièrefunctie vertegenwoordigt de initiërende gebeurtenis van de ziekte. De volgende translocatie van commensale bacteriën en ontstekingsreacties zijn de pijnlijke gevolgen2.
Er zijn verschillende in vitro en in vivo modellen ontwikkeld om de regulering van de AJC teonderzoeken. De Transwell-test is gebaseerd op tweedimensionale (2D) celmonolagen die zijn afgeleid van tumorcellijnen. Deze systemen zijn goed te beoordelen door middel van optische en biochemische methoden en maken de analyse van veel monsters op hetzelfde moment, maar missen vele kenmerken van primaire cellen en de differentiatie processen aanwezig in vivo. Het onderzoeken van de barrièreintegriteit is ook mogelijk in diermodellen. In terminale experimenten kunnen de effecten van specifieke behandelingen in vivo op de doorlaatbaarheid van de hele darm worden gekwantificeerd. Deze modellen vereisen echter een groot aantal dieren en ze staan geen gedetailleerde visualisatie van de onderliggende moleculaire processen toe. Tegenwoordig zijn verbeterde 3D in vitro modellen beschikbaar die nauw samenvatten celdifferentiatie processen, cel polarisatie, en vertegenwoordigen de crypt-villus structuur van de darm3. De toepassing van 3D-darmorganoïden voor functionele analyses vereist de aanpassing van de beschikbare methoden uit 2D-modellen. Hier beschrijven we een model om de integriteit van de darmbarrière in levende kleine darmmuizenorganoïden te onderzoeken. De test werd opgericht om het effect van IFN-γ op de barrièreintegriteit en de respectieve strakke verbindingseiwitten8te onderzoeken.
In tegenstelling tot de techniek toegepast door Leslie4, Zietek5, of Pearce6, die fluorescentie meet na het verwijderen van lucifer geel (LY) van het medium, onze aanpak maakt kwantificering van de luminale opname van de fluorophore na verloop van tijd. Daarom vertegenwoordigt het resultaat een dynamische opname kinetische en onze test maakt de toepassing van extra stimuli of remmers in de loop van het experiment. Het feit dat beide tests de opname van de buitenkant basolaterale kant naar het binnenapicale oppervlak meten, staat in schril contrast met de situatie in vivo. In een model beschreven door Hill et al.7, werd dit onderwerp onderzocht. Na micro-injectie van de fluoropforen in het lumen van de organoïde werd de fluorescentie gekwantificeerd. De richting van diffusie vertegenwoordigt de richting aanwezig in vivo. De technische inspanning van micro-injectie vermindert duidelijk de doorvoer van deze methode. In tegenstelling tot het hier beschreven model, maakt de micro-injectiemethode het mogelijk om effecten te meten die biologische activering op het apicale epitheeloppervlak vereisen.
Het hier gepresenteerde organoïde barrièreintegriteitsmodel is gebaseerd op live celmicroscopie en maakt de analyse van dynamische veranderingen binnen de AJC-verordening in de loop van de tijd mogelijk. De opstelling kan worden toegepast om de farmacologische impact van stoffen die de integriteit van de darmbarrière veroorzaken en remmen te testen. Bovendien helpen organoïde-gebaseerde modellen het aantal dieren dat wordt gebruikt voor farmacologische studies te verminderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze test biedt een techniek om de darmbarrière integriteit binnen levende organoïden te bestuderen. De hele test is gebaseerd op kleine darmmuis organoïden en confocale live celmicroscopie. Daarom is het verplicht om de juiste behandeling van organoïden op voorhand te oefenen. Bij isolatie kunnen organoïden routinematig worden gesplitst en opgeslagen doorcryofreezing 3,9. Voor deze test raden we aan om de organoïden 48 uur te splitsen voordat de behandeling wordt gestart. Deze periode geeft de organoïden de kans om sferische structuren volledig te sluiten en te vormen. Het zaaien van de organoïden voor het experiment is een kritische stap binnen de test. Om individuele handlingvariaties te verminderen, raden we een routineprocedure aan voor het zaaiproces. Deze stap is cruciaal en een routinebehandelingsprotocol vermindert duidelijk experimentele variaties.
Tijdens de zaaiprocedure (stap 1.7) raken de organoïden gefragmenteerd door herhaaldelijk door een standaard 10 μL pipettip te gaan. De porie grootte van dit product varieert van bedrijf tot bedrijf. Deze procedure moet vooraf worden toegepast en het resultaat moet altijd worden gecontroleerd door fasecontrastmicroscopie. Zodra de verkregen organoïden de gewenste grootte bereiken, wijzig de procedure niet.
Het zaaien van de organoïden moet worden geoptimaliseerd en aangepast voor de beschikbare microscopische opstelling. Om organoïden minstens 48 uur te kunnen kweken en imagoen, is een geïncubeerde microscoopkamer absoluut vereist. Kies een chambered coverslip dat aan uw eisen voldoet. Bij het zaaien van de organoïden, zorg ervoor dat de organoïden concentreren op het coverslip oppervlak. Dit is mogelijk door het chambered coverslip 5 min na het plaatsen van de celmatrix-organoïde suspensie op een ijspak te houden. Deze stap is belangrijk om de kwaliteit van confocale live celbeeldvorming te verhogen. De axiale resolutie en werkafstand van confocale microscooplenzen is bijzonder beperkt. Hoe dichter je het monster naar de lens brengt, hoe beter je het in beeld brengen en hoe minder laserenergie nodig is om de LY-fluorescentie op te wekken.
Phototaxis is een belangrijk probleem als het gaat om live cel microscopie. Binnen deze test sluiten we deze optie uit. Een functionele AJC is zichtbaar door uitsluiting van LY van het lumen van de organoïde (Figuur 1, PBS). De toevoeging van EGTA aan het einde van het experiment veroorzaakt sekwestreren van bivalente ionen, die cofactoren zijn voor AJC-eiwitten. LY is alleen uitgesloten van het lumen van de organoïde in vitale organoïden met een functioneel AJC-complex. In het algemeen kunnen fluorescerende moleculen worden gebruikt om de integriteit van de darmbarrière te meten. We kozen voor LY in plaats van andere veelgebruikte fluorophoren zoals fluoresceine gelabeld dextran omdat die transcellig worden vervoerd in darmcellen van de basale naar de apicale compartiment9. We hebben ook gekozen voor LY vanwege het kleine formaat. LY heeft een moleculair gewicht van 457 Da en faciliteert daarom het onderzoek naar de doorlaatbaarheid van de barrière voor kleine moleculen. Het fluorescerende molecuul moet worden gekozen afhankelijk van de onderzochte wetenschappelijke vraag. Omdat fototoxische AJC-defecten aanwezig zijn, moet de laserexcitatie-energie worden verminderd of moet het beeldvormingsinterval worden verlengd. De optimale confocale beeldvormingstechniek voor deze test is het spinnen van discmicroscopie. De respectieve instrumenten maken confocale beeldvorming mogelijk met een korte belichtingstijd bij laag laservermogen.
Er zijn al verschillende modellen ontwikkeld om de integriteit van de darmbarrière in vitro te bestuderen. Terwijl het gebruik van tests op basis van cellijnmonolagen of experimenten in vivo afneemt, nemen op organoïden gebaseerde methoden toe. In tegenstelling tot eerder beschreven methoden4,5,6,7, maakt onze methode kwantificering van de barrièrefunctie in de tijd mogelijk. Hierdoor kunnen de organoïden in de loop van het experiment worden blootgesteld aan extra stimuli. Hier passen we EGTA als een tweede stimulans aan het einde van het experiment als een positieve controle.
In tegenstelling tot de situatie in vivowordt in onze test LY in het medium toegevoegd en dringt het organoïde van buiten basolaterale epitheliale kant naar de binnenkant apicallumen. De LY is klein en wordt alleen gebruikt om de dichtheid van de darmbarrière te visualiseren. Moleculen en stimuli die de epitheliale laag op het apicale oppervlak moduleren, moeten worden geïnjecteerd in het lumen van de organoïde7. Om de experimentele inspanning te verminderen en de barrière-integriteit van veel organoïden tegelijkertijd te kunnen meten, hebben we ervoor gekozen om de fluorescerende kleurstof van buitenaf toe te passen.
We gebruikten de test om de functie van IFN-γ te onderzoeken op de strakke kruising van kleine darmmuizenorganoïden. Het feit dat we in staat waren om de barrière-integriteit in levende organoïden te analyseren biedt toekomstige mogelijkheden om deze techniek toe te passen om remmers te beschrijven voor de ontstekings-geïnduceerde afbraak van de darmbarrière. Stoffen die de door IFN-γ veroorzaakte verminderde barrièrefunctie tegengaan, kunnen kandidaten zijn voor de behandeling van inflammatoire darmziekten, waarbij een verminderde barrièrefunctie een van de pathogene factoren is10.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Duitse Onderzoeksstichting (DFG) [KFO257, project 4 aan M.S. en project 1 aan C.B.; FOR2438, project 2 aan M.S. en E.N. en project 5 naar C.B.; SFB1181 project C05 aan C.B.; TRR241, project A06 to N.B.L. and M.S., project A03 to C.B., BR5196/2-1 to N.B.L. and BE3686/2 to C.B.]; het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) van het Klinisch Centrum Erlangen (aan M.S., E.N., en M.B.), de W. Lutz Stiftung (aan M.S.) en de Forschungsstiftung Medizin van het Klinisch Centrum Erlangen (aan M.S.). Het huidige werk werd uitgevoerd in (gedeeltelijke) vervulling van de eisen voor het behalen van de graad Dr. Med. van Marco Bardenbacher.
Materials
| 48-well culture plate | Thermo Fisher Scientific | #150687 | |
| 8-well chamber slides | Ibidi | #80826 | |
| 96-well culture plate | Greiner Bio-One | #655101 | |
| Axio Observer.Z1 – spinning disc | Zeiss | excitation laser 488 nm / emission filter 525/25 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Centrifugation tube 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 11507411 | |
| Centrifugation tube 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 10788561 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788-25g | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 431788 | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
| Matrigel, growth factor reduced, phenol red free | Corning | 356231 | Cell matrix solution |
| Mice | The Jackson Laboratory | M. musculus C57/Bl6 | |
| Microscope coverslip | 24×60 mm | ||
| Organoid Growth Medium mouse | Stemcell Technologies | #06005 | |
| Phosphate buffered saline | Biochrom | L182-05 | |
| Recombinant murine IFN-γ | Biolegend | Cat#575304 |
References
- López-Posadas, R., Stürzl, M., Atreya, I., Neurath, M. F., Britzen-Laurent, N. Interplay of GTPases and Cytoskeleton in Cellular Barrier Defects during Gut Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1240 (2017).
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infection and Immunity. 83 (1), 138-145 (2015).
- Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion. Scientific Reports. 5 (1), 16831 (2015).
- Pearce, S. C., et al. Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types. BMC Biology. 16 (1), 19 (2018).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
- Tomita, M., Hotta, Y., Ohkubo, R., Awazu, S. Polarized transport was observed not in hydrophilic compounds but in dextran in Caco-2 cell monolayers. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (3), 330-331 (1999).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
