Yaşayan Organoidlerde Bağırsak Bariyerinin Bozulmasının Araştırılması

Tüm adımlar, ilgili tüm düzenleyici ve kurumsal hayvan bakım yönergelerine uygun olarak tamamlanmıştır. 1. Organoidlerin Kaplaması Daha önce açıklandığı gibi organoidleri izole3. Yordam aşağıda kısaca açıklanmıştır. Farelerden ince bağırsakları toplayın. İnce bağırsakları uzunlamasına açın ve iç bağırsak dokusunu bir kapak kaymaile kazıyarak villi uçlarını çıkarın. Makasla bağırsak dokusunu küçük parçalar halinde kesin. Parçaları 25 mL’lik pipetle 10 kat yukarı ve aşağı borulandırarak 5x’i soğuk fosfat tamponlu salinde (PBS) yıkayın. Doku parçalarını soğuk 2 mM EDTA çözeltisi içinde yatay bir sallayarak platformda 30 dk boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Doku parçalarının tortuya izin ver. Doku parçaları alta yerleştikten sonra EDTA çözeltisini PBS tamponuile değiştirin. Supernatant atın ve PBS 20 mL ekleyin. 10 mL’lik bir pipetle 10 x yukarı ve aşağı boru lar atarak bağırsak mahzenlerini dokudan serbest bırakın. Santrifüj tüpleri supernatant toplamak ve faz kontrast mikroskopisi ile inceleyin. Bunu yapmak için, bir 96 iyi hücre kültür plakasupernatant bir damla ekleyin. Santrifüj tüplerini buzda tutun. Toplanan supernatant bağırsak crypts sayısı azalır kadar tekrar adımları 1.1.6-1.1.8. En çok kriptoiçeren kesirleri 70 μm’lik bir hücre süzgecinden geçirin. 300 x g,4 °C’de 5 dk.’lık bir alanda mezar süspansiyonuna santrifüj edin. Supernatant atın ve crypts yıkamak için soğuk PBS pelet resuspend. Daha sonra 1.1.11’de açıklandığı gibi santrifüj adımını tekrarlayın. Hücre matris çözeltisi ve murine organoid kültür ortamının 1:1 karışımının kuyu başına toplam 25 μL’lik kısmını yeniden askıya alın ve 48 kuyuhücre kültürü plakasında organoidleri plakalayın. Hücre matris çözeltisinin katılaşmasını sağlamak için organoidleri 20 dk boyunca 37 °C, %5 CO22’de kuluçkaya yatırın. Organoidleri kuyu başına 300 μL murine organoid orta ile kapatın. Kültür 37 °C, 5% CO2,her 2-3 günde bir orta değişen organoidler. Kültür 7 gün sonra deneyler için organoidler kullanın. Bariyer bütünlüğü ölçümü için organoidleri hazırlayın. Tüm plastik yüzeyleri kapsayacak şekilde PBS’de %0.1 BSA çözeltisi ekleyerek, kaplama işlemi sırasında organoidlerin sığır serum albumini (BSA) ile depolanmasında kullanılacak tüm santrifüj tüpleri önceden kaplayın. Daha sonra BSA çözeltisini tekrar çıkarın ve santrifüj tüplerini buzüzerinde saklayın. Hücre matris çözeltisi ve organoid kültür ortamıbuz üzerinde çözül. Organoidleri ayırmak için, kültür ortamını dikkatlice çıkarın ve 1 mL soğuk PBS’de 48 kuyuluk tabakasının bir kuyusundan organoidleri yeniden uzaklaştırın. Güçlü pipetleme ile hücre matrisini çözün. Organoid süspansiyonu her zaman Santrifüj tüplerinde BSA ile önceden kaplanmış tutun ve her zaman buzda tutun.NOT: Odalı kapak kayması kaydıraklarında bulunan organoidlerin yoğunluğu, büyüklüğü ve konumu, bölünme oranı, hücre matris çözeltisi konsantrasyonu ve organoid-hücre matris süspansiyonunun işlenmesinden etkilenir. Hücre matrisi çözeltisinin işlenmesini önceden uygulamanız önerilir. Genellikle sekiz iyi odalı cam kapakları tayça için uygundur. Bir confluent 48 kuyu plakasının bir kuyudan elde edilen organoidler, sekiz kuyulu coverslip’in iki kuyuya ayrılabilir (her kuyubaşına organoid hücreli matris peletin 40°L). Organoid süspansiyonu 300 x g 4 °C’de 5 dk santrifüj edin. Supernatant’ı dikkatlice atın ve 1 mL soğuk PBS ile peleti yeniden askıya alın. 300 x g,4 °C’de 5 dk.’da organoid süspansiyonu santrifüj edin. Supernatant’ı tamamen atın ve 40 μL soğuk ortamdaki 48 kuyuplakasından elde edilen organoidleri yeniden askıya alın. Fideleme için 40-60 μm büyüklüğündeki yapıları toplamak için organoid süspansiyonu 5 x 10 μL pipet ucuile pipetleyerek büyük organoid yapıları parçalayın.NOT: Organoid yapıların parçalanması için 100°L pipet ucundaki 10 μL ucu kullanın ve tutarlı sonuçlar elde etmek için adım 1.7’yi önceden uygulayın. Santrifüj tüpü içinde faz kontrast mikroskobu ile organoidlerin boyutunu kontrol edin. Daha fazla çok dallı organoid olmadığından ve organoid parçalarının kabaca 40-60 μm uzunluğunda olduğundan emin olun. Organoidler istenilen boyutu elde ettikten sonra, hücre matris çözeltisinin 40 μL’lik kısmıyla karıştırın (orta:hücre matris çözeltisi = 1:1).NOT: Tutarlı sonuçlar elde etmek için orta hücre matris çözüm oranı sabit tutulmalıdır. Hücre matris çözeltisinin seyreltilmesi organoid lekesertliğini azaltır ve difüzyon özelliklerini etkiler. Hücre matris çözeltisi içeren tüm süspansiyonlar için önceden soğutulmuş pipet uçlarını (-20 °C) kullanın. Organoid-hücre matris solüsyonu süspansiyonunun 40 μL’sini 8 kuyunun her kuyunun ortasına yerleştirin. 5 dakika boyunca bir buz paketi üzerinde slayt tutun. Bu hücre matris organoid süspansiyon sıvı korur ve yerçekimi ile coverslip yüzeyinde organoid konsantrasyonu artar. Organoid hücreli matriks lekesinin polimerizasyonunu sağlamak için 37 °C’de 20 dakika ve %5 CO2’de kuluçkaya yatırın. Deneysel tedaviye başlamadan önce kuyu başına 150 μL organoid kültür ortamı ve 37 °C’de 24 saat ve %5 CO2 için kuluçkaya yatırın. Organoidleri tedavi etmek ve bariyer bütünlüklerini ilgili bilimsel hipoteze göre modüle etmek için bu dönemi kullanın. Pozitif kontrol için, IFN-γ ilişkili sıkı kavşak bozulması ve geçirgenlik artışını araştırmak için 48 saat boyunca organoidleri IFN-γ ile tedavi edin. 10 U/mL (10 ng/mL) rekombinant murine IFN-γ ile pozitif kontrolü teşvik edin. Tedavi edilmeyen birinin organoidlerini bırakın. Kültür organoidleri 37 °C ve %5 CO2’de 48 saate kadar. 2. OrganoidPermeability Tsay Organoidleri görüntülerken termal sürüklenmeyi azaltmak için deneye başlamadan önce mikroskobun kuluçka odasını en az 2 saat 37 °C’ye getirin. PBS’de 100 mM LY çözeltisi hazırlayın. Işıktan korunan buz üzerinde saklayın. PBS’de 200 mM EGTA çözeltisi hazırlayın. Buzda saklayın. Organoidler de dahil olmak üzere odacıklı kapak fişini ters konfokal mikroskobunun kuluçka odasına aktarın ve CO2 kuluçka sını açın (%5). Odacıklı kapak kaymasıkıca mikroskop aşamasında kilitli olduğundan emin olun. Bir referans olarak organoidler kullanarak, mikroskobun görüntüleme ayarlarını ayarlayın. 300 μL orta alanda 1 mM LY’lik son bir hacim elde etmek için LY (100 mM LY’nin 3 μL’sini 150°L orta) ekleyin. Mikroskobu 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın ve organoidlerin lümeninin görüntülenmesi için odağı ayarlayın. LY uyarma için gerekli lazer enerjisini (488 nm) ve cihazın algılama hassasiyetini tanımlayın ve kullanılan cihazın mevcut dinamik aralığının -40’ında LY floresanını göremeye çalışın.NOT: LY’nin eklenmesinden 70 dk sonra tedavi edilmeyen organoidlerde lazer uyarma enerjisini ve algılama verimliliğini ayarlayın. Uyarma enerjisinin iyi pozlanmış bir görüntü elde etmek için yeterince yüksek olduğundan emin olun. Mikroskobik görüntülerde LY floresandosu doygunluğunu önlemek için, LY difüzyonu sabit bir duruma ulaştıktan sonra bu ayarların ayarlanması önerilir. Diferansiyel girişim kontrastı (DIC) canlı görüntüleme ile organoidlerin konumunu tanımlayın. Benzer çaplarda (80 ± 30 μm) organoidleri resmetmeye çalışın ve lümenlerini görmek için organoidlerin merkezi dilimine odaklanın. Kuyu başına yaklaşık 10 organoid tanımlayın ve küresel bir yapıya sahip kapak yüzeyine sadece organoidleri göremeye çalışın.NOT: Her koşuda görüntülenebilen organoidlerin sayısı mikroskobun hızına bağlıdır. Organoidlerin 5 dk aralıkta görüntülemi tavsiye edilir. Düzenli bir lazer tarama mikroskobunda, toplam 40 pozisyon makul bir başlangıç noktasıdır. Bariyer bütünlüğü için kullanılan LY’yi kuyulara eklemeden önce organoidin şeklini ve otofloresansını belgelemek için her pozisyonun DIC ve LY floresanını kaydedin. Yüksek otofloresan gösteren organoidleri görüntülemeyin. Bu organoid lümen içinde ölü hücrelerin birikimi nedeniyle, ve otofloresan organoidlerin sonuçları daha sonra analiz etmek zordur. Hazırlanan LY çözeltisinin 3 μL’sini seyreltin (150°L ortadaki 100 mM LY) ve odacıklı kapak kaymasına dokunmadan her kuyuya dikkatlice ekleyin. Kuyu başına önerilen LY konsantrasyonu 1 mM’dir. Kuyu başına son hacim 300 μL olmalıdır. Tanımlanan pozisyonların odak noktasını hızlı bir şekilde kontrol edin ve gerekirse düzeltin.NOT: LY hücre matrisi aracılığıyla hızlı bir şekilde yayılır. Bu nedenle, konfokal görüntüleme florofor ilavesi sonra 3 dakika içinde başlanmalıdır. Mikroskopta hızlandırılmış bir görüntüleme başlatın. Toplam 70 dakika boyunca her 5 dakikada bir her pozisyonun floresan görüntüsünü alın.NOT: Organoidler LY alımını zaman içinde görselleştirmek için 5 dakika aralıklarla görüntülendi. Bağırsak bariyerinin bozulmasını ölçmek için LY ilavesinden önce ve 60 dk sonra ve EGTA ilavesinden sonra bir kez daha 10 dk floresan kaydetmek yeterlidir. Hazneli kapak kaymadokunmadan iyi başına hazırlanan EGTA çözeltisi 3 μL ekleyin. EGTA’nın odalı kapak kayması içinde önerilen konsantrasyon 2 mM’dir. Kuyu başına toplam hacim 300 μL olmalıdır. İkinci bir zaman atlamalı başlatın. Tanımlanan organoidlerin floresansını toplam 30 dakika boyunca 5 dk aralıkla tekrar kaydedin. Yerel güvenlik yönetmeliklerine göre her şeyi atın.NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. 3. Veri Analizi Sadece EGTA ilavesi sonrası LY’ye gelen organoidlerin sonuçlarını analiz edin. Sonuçlar Fiji ImageJ ile ölçülebilir. Dosya’ya tıklayarak ImageJ’de veri kümesini açın | Resim verilerini açın ve seçin. Aşağıdaki BIO-Formats Alma seçenekleri iletişim kutusunda Aşağıdaki Ile Görünüm yığınını seçin: Hyperstack. Analyze ‘ı tıklatarak ilgi alanı (YG) yöneticisini açın | Araçlar | YRK Yöneticisi. ImageJ menü çubuğundaki Oval seçim düğmesine tıklayarak oval bir yatırım getirisi çizin. Organoidiç lümeniçeren bir seçim çizin. Ardından Yatırım Getirisi Yöneticisi’ni Ekle’ye basın. Organoid dışında üç temsili alanlar için adımları tekrarlayın. Menü çubuğunda Analiz et’e tıklayın ve Ölçüleri Ayarla’yıseçin. Yalnızca Ortalama Gri Değeri etkinleştirin ve diğer ölçümleri devre dışı alın. Sonra Tamam’ıtıklatın. Tüm ROI’ların YG Yöneticisi’nde seçildiğinden emin olun. Yatırım Getirisi Yöneticisi’nde Daha Fazla | Çok ölçü . Seçenek iletişim kutusunda tüm […] dilimlerini ve dilim başına bir satırıölçün’i seçin. Sonra Tamam’ıtıklatın. Sonuçlar penceresindeki tüm değerleri seçin ve daha fazla analiz için bunları bir elektronik tablo uygulamasına kopyalayın.NOT: Zaman atlamalı görüntüleme sırasında organoidin pozisyonu hareket ettiyse, Yatırım Getirisi buna göre ayarlanmalıdır. Bunu yapmak için, YG yöneticisinde doğru yg’yi seçin ve yeni konuma taşıyın. Ardından YG yöneticisinde Güncelleştir’i tıklatın. YG yöneticisinde Ölçü’yü tıklatarak her zaman noktası için ölçümü ayrı ayrı gerçekleştirin ve alttaki çubuğu kullanarak görüntü penceresindeki bir sonraki zaman noktasına geçin. Tüm ölçümleri elektronik tabloda toplayın. Görüntüleme döneminde organoidlerin bireysel şekli ve hareketi verilerin manuel bir şekilde analizini gerektirir. Her zaman dilimi için organoid dışında üç ROI ortalama yoğunluk değerini hesaplayın. Roi’nin organoidlünin lümeniçindeki yoğunluğunu dışarıdaki yatırım getirisinin ortalama yoğunluğu namına ve organoidin içindeki ortalama yoğunluğuna bölün. Luminal organoid floresangöreceli artış hesaplamak için, en az bağıl floresan tarafından görüntülanan her zaman noktasında bağıl floresan (bkz. adım 3.11) bölün.NOT: Florofordifüzyon uyğun deneyin başında yavaş olabilir, çünkü minimal göreceli floresan kullanın.