여기에 제시된 것은 싱크로트론 극저온 X선 나노프로브를 사용한 X선 형광 이미징 이전에 실리콘 질화물 멤브레인 및 플런지 동결에 대한 세포 배양 프로토콜이다. 실온 나노 분석만 이 제공되면, 동결된 시료는 더욱 동결건조될 수 있다. 이들은 세포내 원소 조성물에 대한 정보를 얻기 위한 중요한 단계이다.
세포 외 수준에서 금속 이온의 분포에 대해서는 거의 알려져 없습니다. 그러나, 그 화학 요소는 필수적인 규제 기능을 가지고 있고 그들의 방해된 항상성각종 질병에 관여합니다. 최첨단 싱크로트론 X선 형광 나노프로브는 2차원(2D) 및 3차원(3D) 금속 의 분포 및 전체 세포 내부의 금속 농도를 해명하는 데 필요한 감도 및 공간 분해능을 제공합니다. 세포 수준. 이것은 세포의 생리병리학에 있는 금속의 역할에 조사의 새로운 흥미진진한 과학적인 필드를 엽니다. 세포 준비는 키와 종종 복잡 한 절차, 특히 기본 분석에 대 한. X 선 형광 기술이 지금 광범위하고 각종 준비 방법이 이용되었더라도, 아주 몇몇 연구 결과는 세포의 원소 내용의 보존을 기껏해야 조사하고, 극저온 준비를 위한 단계적으로 상세한 프로토콜이 없습니다 X선 형광 나노프로브에 대한 부착 세포는 지금까지 출시되었습니다. 이는 동결된 수화 상태에서 세포의 싱크로트론 X선 형광 나노 분석을 가능하게 하는 빠른 저온 광에 대한 단계적 세포 제제를 제공하는 프로토콜에 대한 설명이다. 나노 분석이 실온에서 수행되어야 하는 경우, 냉동 고착 부착 세포 제제를 동결 건조하기 위한 추가 적인 절차가 제공된다. 제안된 프로토콜은 유방암 세포에 있는 유기금속 화합물의 2D 및 3D 세포 내 분포를 공부하기에서, 전작에서 성공적으로 이용되었습니다.
새로 설계된 싱크로트론 X선 형광(SR-XRF) 나노프로브는 완전히 정량적인 방식으로 요소의 세포외 분포를 시각화할 수 있게 합니다. 예를 들어, 이 분석 능력은 오스뮴 기반 복합체2와같은 나노 입자1 또는 유기 금속 분자의 섭취를 조사할 수 있게 하여 강력한 항암 특성을 가진 금속 기반 분자의 세포내 섭취에 대한 통찰력을 제공합니다. 다요소 기술로서 나노프로브를 사용한 SR-XRF3는 인, 황, 칼륨, 칼슘, 철, 구리 및 아연을 포함한 세포내 가장 중요한 원소를 동시에 정량화하고 국소화할 수 있는 방법을 제공합니다. 실제로, 하드 엑스레이의 사용은 라벨이없는 방식으로 전체 냉동 수화 세포를 이미지에 큰 침투 깊이를 제공합니다. 또한, 관심있는 대부분의 요소의 K-에지에 대한 액세스를 제공, X 선 형광은 가장 효율적으로 흥분된다. 극저온 접근법의 사용은 방사선 손상의 감소와 세포 구조 및 원소 분포의 보존의 최적화를 허용합니다.
세포에서 금속을 연구하기 위해 공간적으로 해결된 대부분의 분석 기법은 세포의 매우 얇고 평평한 부분의 생산이 필요한 표면 기술입니다. 이것은 주로 에너지 분산 X 선 분석 (STEM-EDX), 에너지 여과 된 전송 전자 현미경 검사법 (EF-TEM), 및 나노 스케일 이차 이온 질량 분광법 (nanoSIMS)를 가진 스캐닝 전송 전자 현미경 검사법을 포함합니다. 후자는 냉동, 수화 세포 섹션에서 수행 할 수 없으며 저온 분석은 타의 추종을 불허하는 공간 해상도를 가진 전자 현미경 검사법으로 수행 할 수 있지만 원소 감도가 좋지 않습니다. 입자 유도 엑스레이 방출 (PIXE)는 전체 세포에서 원소 분포의 연구를 허용했습니다. 미크론 스케일과 서브미크론 해상도4에서도공정한 원소 감도로 완전히 정량화되는 장점이 있지만, 방사선 손상과 냉동 수화 세포를 연구하는 극저온 능력의 부족으로 고통받고 있습니다. 이 모든 분석 기술은 세포의 원소 화상 진찰에 있는 각각을 보완합니다, 그러나 모든 기술에 대한 견본 준비 절차는 중요한 단계입니다. 의미 있는 결과를 얻기 위해 가능한 오염뿐만 아니라 원소 재분배 및/또는 누출을 제한하기 위해 단순하게 유지해야 합니다. 전자 현미경검사법에서 입증된 바와 같이, 극저온 세포의 극저온 고정화 및 저온 스캐닝 단계로의 극저온전달을 포함하는 극저온 워크플로우는, 원어민 상태5,6,7,8,9,10에가능한 한 가까운 세포 내 수준에서 최적의 원소 보존을 가능하게 한다. 이러한 이해는 2D 또는 3D로 전체 냉동 수화 세포의 초구조 이미징을 생성하기 위해 싱크로트론 저온 연약한 X 선 현미경 검사법 (예 : 전체 필드 현미경 및 스캐닝 현미경)의 개발에 성공적으로 구현되었습니다. 로렌스 버클리 국립 연구소 12, 전자 저장 링 BESSY II (독일)13,ALBA 광원 (스페인) 14의 빔 라인 MISTRAL ,14,빔 라인 B2에서 로렌스 버클리 국립 연구소12의고급 광원의 Beamline 2.1 (XM-2)에서 부드러운 X 선 현미경을 위해11을 개발하였다. 유사한 워크플로우가 최근 X선 마이크로프로브16,17을이용한 세포내 원소 분석을 위한 가장 신뢰할 수 있는 준비 및 보존 방법으로 나타났다.
X 선 나노 프로브 기술은 세포 원소 분석에 널리 사용되기 시작하지만, 특히 극저온 SR-XRF 기능의 출현과 함께, 어떤 단계적 프로토콜은 지금까지 연구 커뮤니티에 보급되지 않았습니다. 여기서, 극저온 조건하에서 분석될 실리콘 질화물 멤브레인상상에 단층으로 배양된 저온 고정 부착 세포를 제조하기 위한 상세한 절차가 제공된다. 실온에서 X선 분석을 수행해야 하는 경우에 대비하여 프로토콜 이후에 적용되는 동결 건조 단계도 제공됩니다. 제안된 프로토콜은 인간 유방암 세포MD-MB-2312와 함께 성공적으로 사용되었지만 동결건조는 마우스 뉴런18,20,21에서다른 사람들 사이에서 입증되었으며, 다양한 유형의 인간 또는 동물 세포로 용이하게 확장될 수 있다.
저온전자 현미경(cryo-EM)은 2017년 노벨 화학상을 수상했으며, 이에 따라 용액25에서생체분자의 고분해능 구조 판정을 위한 생물학적 물질의 유리화에 대한 J. Dubochet의 개발이 이루어졌습니다. 그의 노벨 강의에서 Dubochet에 의해보고 된 바와 같이 “물 방울을 vitrify하는 방법을 아는 것은 한 가지, 생물학적 관찰을위한 생물학적 샘플을 준비하는 것은 또 다른 것입니다”25. 냉동 준비 단계는 이제 방사선 선량 손상을 완화하고 자신의 모국에 가까운 세포를 연구하는 표준 기술로 간주됩니다. 그러나 준비는 지루한 남아 있습니다. 이것은 전자 현미경 검사법, 그것의 타의 추종을 불허하는 공간 해결책 때문에, 견본 준비 도중 생기는 어떤 초구조적인 유물든지에 민감하기 때문입니다. 싱크로트론 cryonanoprobes는 지금 고에너지 엑스레이 범위26에있는 13 nm의 낮은 공간 해상도로 내려가는 유사한 어려움에 접근하고 있습니다. 단단한 엑스레이 현미경 검사법은 전자 현미경 검사법은 아주 얇은 세포 조각을 관찰할 수 있게 하는 전자의 가난한 침투 깊이 때문에 손해를 입는 동안 전체 세포를 분석할 수 있습니다.
세포의 단층은 충분히 얇아서 액체 에탄의 급락 동결에 의해 물 유리화에 필요한 냉각 속도를 얻을 수 있습니다. 이론적으로, 108 K/s의 높은 냉각 속도는 급락 동결에 너무 두꺼운 시편의 유리화를 허용하는 고압 동결27을 사용하여 가능합니다. 주변 압력28에서시료의 완전한 유리화를 허용하는 데 필요한 105 K/s의 냉각 속도는 여기에 제시된 자동 플런지 동결 기계 및 파라미터를 사용하여 재현가능하게 도달합니다. 이것은 연구원이 액체 에탄에 있는 급락 동결에 의하여 세포의 단층12,13,14,15,29,30와 같은 얇은 생물학 견본 (<10 μm)를 vitrify할 수 있습니다.
이 프로토콜의 중요한 과제는 세포 내 의 화학적 무결성을 가능한 한 많이 보존하여 세포 내의 신뢰할 수 있는 원소 분포를 2D 또는 3D로 제공하는 것입니다. 다른 곳에서 발표 된 바와 같이2,16,17,31, 세포 내 수준에서 원소 이미징의 경우 냉동 수화 세포의 분석을 고려해야합니다. 그렇지 않으면, 셀의 플런지 동결 및 동결 건조의 조합은 실온 분석에 사용될 수있다. 후자의 경우, 비정질 얼음은 승화 과정을 통해 제거되고 결합 된 물 분자는 탈착 과정을 통해 제거됩니다. 이러한 과정은 세포막의 가능한 변경 및 일부세포구조(32)의형태로 인해 동결된 수화 샘플에 비해 이상적이지 않을 수 있다. 또한, 견본 연구의 경우, 물 추출은 금속 표본 유물로 이어질 수 있습니다. 여전히, 그것은 성공하고 하위 100 nm 수준2,16,17,18,20,33,34,35,36에서원소 이미징을위한 냉동 수화 샘플에 대한 최선의 대안이었다.
37로보고된 바와 같이, 저온 보존 된 세포 제제의 품질은 칼륨 대 나트륨 K / Na 비율을 통해 평가 될 수 있습니다. 불행히도, 요소의 X 선 형광 광자를 검출하는 데 사용되는 실리콘 드리프트 검출기의 낮은 에너지 차단으로 인해 여기에서 사용되는 하드 X 선 나노 프로브로 아직 결정될 수 없습니다 (E ≥ 1.3 keV 마그네슘). 실제로, TOF-SIMS, EPMA, 또는 핵 마이크로프로브 PIXE16을사용하여 측정할 수 있는 높은 K/Na 비율(>10)은 살아있는 셀(37)에서예상되는 K/Na(25)와 비교하여 세포의 보존된 화학적 무결성을 나타낸다. 이것은 수반되는 낮은 Cl/K 비율38에의해 지원될 수 있습니다. 여전히, 불완전한 유리화, 특히 시료 냉각 속도가 너무 낮은 경우, 세포막과 세포기관을 손상시킬 수있는 큰 얼음 결정의 형성으로 이어질 수 있습니다, 결과적으로 화학 원소의 분포를 변경. 이러한 잠재적인 손상과 세포내 분포에 미치는 영향을 모니터링하는 일상적인 절차는 없지만, 위의 원소 비율과 X선 위상 대비 또는 극저온 연약한 X선 현미경을 사용하여 고해상도로 세포를 이미지화할 수 있는 가능성은 원소 무결성의 수반되는 보존과 함께 세포내 구획의 양호한 보존을 지원하는 가장 좋은 방법이 될 수 있습니다. 이러한 기술의 조합과 새로 개발 된 극저온 형광 광학 현미경의 사용은이 손상이 발생하고 세포 내 원소 분포에 영향을 미치는 정도를 평가하는 데 도움이됩니다.
전반적으로, 싱크로트론 X선 형광 나노 분석을 위한 세포 샘플을 준비하는 상세하고 포괄적인 프로토콜이 제시된다. 그것은 연구 사회를 위한 좋은 출발점, (cryo) 하드 X 선 나노 프로브에서 2D 및 3D 원소 이미징에 대 한 적절 한 세포 샘플을 준비 하는 방법의 어려운 문제를 해결 하는 데 도움이. 이러한 접근법은 세포의 심층적인 상관 관계 화학 및 구조 이미징을 위해 광학 형광 및 전자 현미경 기능과 병합될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
나노 이미징 빔라인 ID16A에 대한 실험은 ESRF 제안 LS2430, LS2303, 및 LS2765의 프레임에서 수행되었다.
Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O | SIGMA | 09691-250mL | One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway. |
B27 supplement, 50x | Life Technologies, Invitrogen | 17504-044 | for hippocampal neuron culture |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2) | GIBCO | 14190-094 | cell culture |
DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification) | GIBCO | 21885025 | cell culture |
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Life Technologies, Invitrogen | 31966-02 | for hippocampal neuron culture |
Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05×0.01mm Tips, Biology | World Precision Instrument | 501202 | |
Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer | Quorum Technology | EK3147 | |
Ethane N45 | Air Liquid | p0505s05r0a001 | C2H6 > 99,995 % |
Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin | GIBCO | A31604-02 | cell culture |
HBSS 10x | Life Technologies, Invitrogen | 14185-052 | for hippocampal neuron culture |
Leica GP quick-release forceps | Leica | 16706435 | |
MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell | ATCC | ATCC HTB-26 | cell culture |
Neurobasal medium | Life Technologies, Invitrogen | 21103-049 | for hippocampal neuron culture |
Nunc 4-Well Plate | Thermo Fisher | 176740 | cell culture |
Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer | Advanced Instruments | Osmo1 | Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO® Vapor Pressure Osmometer) |
Penicillin-Streptomycin | SIGMA | P4333 | cell culture |
poly-L-lysine | SIGMA | P4707 | Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged). |
Plunge freezing robot Leica EM GP main unit | Leica | 16706401 | Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing. |
Silicon nitride membrane (Si3N4) | Silson Ltd. | SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl | The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane…) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco… |
Trypan blue solution 0.4% | GIBCO | 15250061 | cell culture |
Trypsin-EDTA, 0.05% | GIBCO | 25300-054 | cell culture |
Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water | Fisher Chemicals | W9-1 | MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis. |
Whatman No. 1 filter paper with precut hole | Leica | 16706440 | Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used. |