תרבות התא על ממברנות הסיליקון נידהר וקריופיקציה עבור סינכרוטרון X-ray פלואורסצנטית ננו-ניתוח

הליכים ניסיוניים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של החטיבה למדעי החיים של הצ (CETEA, A14-006). הם נערכו בהתאם לחקיקה הצרפתית ולהוראת מועצת הקהילה האירופית של 24 בנובמבר 1986 (86/609/EEC). 1. סיליקון נידהר (Si3N4) הכנה לתמיכה ממברנה הערה: בגלל הקרום הוא שברירי ועדין, התמיכה שלה (200 יקרומטר עבה מסגרת סיליקון) צריך להיות מטופל בעדינות, באופן אידיאלי עם מלקחיים פחמן דק או דומונט מלקחיים #5, ישר עצמית סגירה עצות קנס. פרוטוקול זה השתמשו סיליקון ממברנות ניטריד עם מסגרת של 5 מ”מ x 5 מ”מ וגודל קרום של 1.5 mm x 1.5 מ”מ. הקרום צריך להיות מוכן בערך 12 h לפני תחילת הניסוי (כלומר, זריעת תאים). ניתן להכין ממברנות בסוף היום ולהתייבש במשך הלילה מתחת לכיתה ב’ לכיוון כיסוי הזרימה, כך שהם יהיו מוכנים לשימוש למחרת בבוקר. עובי מסגרת סיליקון של 200 יקרומטר הוא סטנדרטי עבור רוב החברות שמוכרות חלונות הסיליקון ניטריד. אם המוצר המשמש בפרוטוקול זה אינו זמין, ניתן להשתמש בגודל ממברנה בטווח של 0.5-1.5 מ”מ עם גודל מסגרת סטנדרטי של 5 מ”מ x 5 מ”מ. גודל הממברנה הגדול יותר מועדף כאשר נעשה שימוש בטומוגרפיה של קרני רנטגן. ברשת TEM סוג סיליקון ניטריד חלונות עם גודל קרום של 0.5 מ”מ ועובי של 50 ננומטר יכול לשמש גם. פתח את הקפסולה המכילה את התמיכה ממברנות Si3N4 (איור 1). לחץ בעדינות על הקפסולה כדי לשחרר בקלות את התמיכה. החזק את אחת הפינות של מסגרת הסיליקון באמצעות מלקחיים דקים. להיזהר לא לגעת Si3N4 ממברנה במרכז. 200 או 500 ממברנה עבה ננומטר ניתן לפגוע בקלות. באמצעות מלקחיים דקים, בעדינות למקם את Si3N4 ממברנה התמיכה צלחת פטרי מזכוכית סטרילית, משטח שטוח של החלון הסיליקון הנידהר פונה כלפי מעלה (כלומר, החלל הפונה לתחתית המנה). הסר את המכסה של צלחת פטרי והשאר את הקרומים תחת אור UV במשך 25-30 דקות מתחת לארון הזרימה המבינארי.הערה: הנורית UVC (254 nm) מוגדרת בדרך כלל ב-200 μW/cm2. שים 10 μL של פולי-L-ליזין על הקרום. הירידה צריכה לכסות את Si3N4 היטב ממברנה והוא יכול להתפשט קצת מעל מסגרת סיליקון. השאירו אותו ב 37 ° c עבור 25 דקות בחממה רגילה לתרבות רקמות ב 100% לחות יחסית ו 95% אוויר, 5% CO2.הערה: במקרה זה ציפוי פולי-אל-ליזין שימש לתאי סרטן החזה מד-ה231. בהתאם לסוג קו התא, ניתן להשתמש בציפויים שונים, והשלב הזה צריך להיות מיטבי בהתאם. ב 48 סטרילי צלחת הבאר, למלא בארות שונות עם 200-250 μl של אולטרה טהור ואולטרה מעקב מים מסוננים באמצעות מסנן סטרילי משנת 0.22 יקרומטר. בדרך כלל, ניתן להשתמש בכל טוב כדי לשטוף עד 2-3 ממברנות. באמצעות מלקחיים עדינים, לאסוף את התמיכה הממברנה בפינה של מסגרת הסיליקון שלה. לשטוף את הקרום בעדינות על ידי תת מיזוג אותו אנכית 10 s בשלוש בארות רצופות.הערה: התמיכה בקרום נלקח מתוך החממה וניתן לעבד אותה בטמפרטורת החדר, עם הטמפרטורה והלחות המוגדרת על-ידי מחלקה 2 של כיסוי זרימה למינארי. לשים את התמיכה הממברנה אנכית בבאר ריקה של צלחת 96 ומלא סטרילי, לכסות אותו, ולתת לו להתייבש בלילה תחת Class II לאורך כיפה הזרימה. 2. זריעת תאים בצלחת 4 היטב סטרילית, הניחו את הקרומים עם הצד השטוח שלהם פונה כלפי מעלה. מד א-MB-231 תאים נשמרים בתרבות דופלקס ב dmem עם פנול אדום/גלוטמקס I, שיושלם עם 10% סרום עגל עוברי ו 1% פניצילין ו סטרפטומיצין ב 37 ° צ’ ב 5% CO2 האוויר מחולל החממה. כאשר התאים מגיעים ל-60 ש-70% שליטה מסירה את המדיה ממנה או מבקבוקון. לשטוף 1 x עם 10 מ ל של מלוחים של Dulbecco הפוספט באגירה ללא Ca2 + או Mg2 +. הוסף 3 מ”ל/T75 בקבוקון של 0.05% טריפסין/EDTA פתרון ולהבטיח כי המונאולייר כולו מכוסה בתמיסה טריפסין. המשך 3-5 דקות ב 37 ° צ’ עד שהתאים מתחילים להתנתק. הטיפול צריך להילקח לא יותר-טריסינטזציה של התאים ולא לאלץ את התאים להתנתק בטרם עת. הוסף 8 מ ל של DMEM בתוספת עם 10% סרום העוברי העובר ו 1% פניצילין ו סטרפטומיצין או מדיה מלאה לאסוף את התאים על ידי ליטוף. הנסיוב בתקשורת ינטרל. את הטריפסין ספין למטה ב 250 x g עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר. . ומכה את הסופרנטאנט הוסף 8 מ ל של מדיה מלאה טרי אל הצינור 15 מ”ל המכיל את הגלולה התא, ו ללטף את התאים למעלה ולמטה עד התאים הם התפזרו לתוך תא אחד ההשעיה. לספור את התאים באמצעות הומוציטוטומטר ולדלל את הריכוז של 5 x 106 תאים לכל mL במדיה מלאה (Dmem עם פנול אדום/1% של 200 מ”מ L-alanyl-l-גלוטמין dipeptide ב 0.85% הפתרון בתוספת עם 10% סרום עגל עוברי ו 1% פניצילין ו סטרפטומיצין). לקחת 10 μL של מד א-MB-231 תא הבולם והפקדה אותו על קרום. זה מתאים 50,000 תאים/10 μL עבור מד א-MB-231. הירידה צריכה לכסות את Si3N4 היטב ממברנה והוא יכול להתפשט קצת על מסגרת סיליקון. הטיפול צריך להילקח לא לגעת Si3N4 ממברנה עם קצה של המיקרופיפטה.הערה: בהתאם לסוג קו התאים והניסויים או המידות, צפיפות התא עשויה להשתנות ולהיבדק בהתאם. כאן, צפיפות התא המוצע עבור זריעת Si3N4 ממברנה נמצאה אופטימלית עבור התנאים ניסיוני ו-SR-xrf NANO-ניתוח של מד א-MB-231 תאים2. עבור נוירונים היפוקמאל (ח נ), להסיר את רקמת המוח ההיפוקמפוס מן היום העובריים 18.5 עכברים ולעכל את זה ב 0.25% טריפסין ב hepes-hbss (5.3 מ”מ kcl, 0.44 mm KH2הפו4, 137.9 מ”מ הנאל, 0.34 מילימטר ב2po4,5.56 מילימטרגלוקוז) ב 37 ° c באמצעות P1000 מP1000 וטיפ P200, לבצע את הדיסוציאציה המכנית על ידי ציור ושחרור התוכן חרוט עם הפיפטה מספר פעמים. במהלך שלב זה, להיזהר לא ליצור בועות אוויר במדיום, כי בועות האוויר רעילים לנוירונים. המתן מספר דקות עד שהצבירה מצטברת בתחתית השפופרת. העבר את הסופרנטנט המכיל את התאים המפוזרים לצינור אפנדורף סטרילי. השאר ~ 25 μl של התרבות הבינונית המכילה את הצבירה. ספירת התאים שאינם מתאיהם באמצעות הטציטומטר. מבודדים הנוירונים HN מצופים בריכוז של 7 x 104 תאים ס”מ-2 על פולי-l-ליזין (1 מ”ג/mL פולי-l-ליזין)-מצופה ממברנה הסיליקון ניטריד. רק עבור ממברנות עם ח נ, מודדת את הנוירונים ב Dמאמ הראשון שיושלם עם 10% סרום בפרה עוברית. אחד h לאחר ציפוי HN ב dmem, המדיום משתנה מדיה ציפוי נוירובסיס (200 mM L-alanyl-l-גלוטמין dipeptide ב 0.85% הפתרון הנאקל, ו B27 תוסף d = 1/50 מדולל נוירובסיס)18,19. עבור התאים מד א-MB-231, לשים את הקרום תומך ב 37 ° צ’ בחממה (100% לחות יחסית, 95% air ו 5% CO2) עבור 25 דקות. הדבר מאפשר לתאים להתיישב ולהתחיל לצרף למצע. הדבר עשוי להיות מותאם בהתאם לקו התא המשמש. להוסיף 1 מ ל של בינונית התרבות המלאה הנדרשת (DMEM עם פנול אדום/1% של 200 mM L-alanyl-L-גלוטמין dipeptide ב 0.85% הפתרון בתוספת עם 10% העגל העוברי סרום ו 1% פניצילין ו סטרפטומיצין) בכל טוב של מד א-MB-231 תאים על ידי הצבת את העצה הפיפטה נגד קיר של פלסטיק היטב ושחרור המדיום לאט מאוד בזמן שהוא מכסה את הקרום. לשים את הממברנה אנכית על הקיר של 4 צלחת הבאר כדי לקחת משם כל בועות אוויר לכוד בחלל הבאר של Si3N4 ממברנה (איור 2). כדי לעשות זאת, להשתמש בפינצטה עדין לדחוף את הבועה בעדינות רבה, נע במקביל Si3N4 מסגרת האחורי כדי למנוע נגיעה ונזק קרום. לשים את הממברנה בחזרה אופקית בתחתית הבאר ולהשאיר את הצלחת 4 הבאר בחממה לזמן הנדרש בהתאם לקצב הצמיחה של קו התא בשימוש. התאים מד א-ב-231 מודלו לילה. 3. טיפול או שינוי בינוני הסר את המדיום מ 4 צלחת הבאר. לשטוף פעם אחת עם 1 mL של פתרון PBS ב 37 ° c. התעלם מערוץ ה-PBS והוסף 1 מ ל של המדיום הרענן והמלא בנוכחות או בהעדר (פקדים) של הטיפול הרצוי באמצעות טיפ של 1 מ ל, שחרור הנוזל מאוד לאט נגד הקיר של צלחת הבאר. את Si3N4 ממברנה צריך להיות שקוע באיטיות ללא כל הפרעות כדי למנוע תנועה ממברנה או להרים. 4. הכנה להקפאה של ההכנה התאית בהקפאה הערה: בתום זמן הדגירה הנדרש, בנוכחות או בהעדר הטיפול, יש לשטוף בזהירות את התאים ולתקן את ההקפאה. בסביבות 30 דקות לפני התחלת לשטוף ולמחוק את ההכנה התאית לפני הקפאה-לקפוא, הגדרת הראשון וקריר במורד מכונת המקפיא האוטומטית לצלול. כאשר אתה מתפעל קריוגנים, השימוש בכפפות קריוגניים מתאימים, משקפי בטיחות, נעליים סגורות, ומעיל מעבדה נדרשים. חנקן נוזלי חייב להיות מועבר בתוך Dewars מתאים, ואת מקום העבודה צריך להיות מאוורר מספיק עם נוכחות של צג חמצן. באופן אידיאלי, רמת היגרומטריה נמוכה של 20-30% מסייעת להגביל את זיהום הקרח של חומרים, Dewars, ו קריוגנים, כי הוא מזיק לויטריפיקציה של דגימות (כלומר, שכבת קרח אמורפיות). באופן אידיאלי, בהתאם לרמת הניסיון של החוקר, עד 10-12 לאחד דגימות עבור הפעלה אחת ניתן להכין באמצעות משנה אותו הגביע הנוזלי משני הקריוגן עבור ויטריפיקציה. בין הפעלות, המקפיא לצלול אוטומטי דורש 1 h לאפות הליך החוצה. באופן אידיאלי, יש לעבד דגימות בתנאי דגירה זהים. עדיין, ניתן לעבד פקדים תחילה, ואחריהם הדגימות בתנאי טיפול מסוים. הערה: עבור הקפאה-מקפיא הצעדים הבאים חלים הן על התאים מד א-MB-231 או בתאי HN. הגדר את הקריוקרינגר. לקריוקיבעון מהיר של תאים . תדליק את מקפיא הצלילה האוטומטי הזן את הפרמטרים (למשל, טמפרטורה, אחוז לחות, הזמן לחסום אם בלוק אוטומטי משמש, ומיקום להרים את המדגם על פני השטח של הקריוגן כדי להקל על העברה מכולה קריוגניים) ישירות מהמסוף והפרמטרים תפריט ‘ הגדרות ‘. במקרה הנוכחי, הפרמטרים של תא הלחות הוגדרו כ-37 ° c ו-80% לחות.הערה: טוב יותר ויטריפיקציה תוצאות התקבלו עבור פרוטוקול זה ו-X-ray הדמיה מהירה וזהירה ידנית. לפיכך, הפרוטוקול אינו משתמש בתוכנית רצף אוטומטית. חברו את חדר מכשיר האדים ובכדי לשמר את הלחות הראשונה למלא אותו באמצעות מזרק עם 60 mL של מים כפולים מזוקקים, ולאחר מכן 20 mL כפי שנקרא במסוף המקפיא האוטומטי לצלול.הערה: הימנע משימוש במים אלקטרופורזה כי זה עלול לגרום נזק מערכת אידוי. סגור את השסתום ולהשאיר את האבובים מוצמד על הישבן של מכשיר האדים. התקינו את הספל השחור למחזיק בה וכיסו אותו בעזרת כובעי הפלסטיק. למלא את Dewar של החדר הקר עם LN2, להביא אותו לרמה של הרשת בתוך אזור העבודה. שים את המיכל הייעודי כדי לאחסן את הקרומים לאחר קריוקיבעון במיכל העברת שנערך במיקום הייעודי באזור העבודה EM-GP וקרוב מחזיק הגביע אתאן.הערה: המנה הייעודית היא התפתחות בבית ב-nanoprobe beamline ID16A של קרינת הסינכרוטרון האירופית בגרנובל. ציורים עם מפרטים זמינים לפי בקשה (איור 3). הם יכולים להיות מאוחסנים ארבעה בכל פעם בצינור 50 mL לטווח ארוך אחסון LN2 Dewar. אפשרות חלופית מורכב באמצעות קטן 0.2 mL הקיר הקבוע PCR דק עם כובעי כיפה לאחסן אחד Si3N4 ממברנה תמיכה. יהיה עליך לקדוח ~ 2 מ”מ חור בחלק העליון של צינור הקיר באמצעות מחט מזרק מחומם כדי לאפשר LN2 למלא את הצינור. מלאו את המכולה עם LN2 וכיסו אותו במכסה האלומיניום הייעודי. המשך למלא את החדר הקר עם LN2 (בדרך כלל ~ 2 יש צורך) שמירה על 100% צג LN2 ברמה במסוף. המתן עד להגעת הטמפרטורה הנדרשת הסופית. הסירו את כובע הפלסטיק וכסו את הגביע האטיאן עם הliquefier המחוברים לבקבוק אתיאן. המתן עד שטמפרטורת הספל. תהיה מעורפלת לטמפרטורת הטמפרטורה בעת ההגעה, התחל להשתמש בקריוגן המשני (כלומר, ethane).הערה: ה-setpoint ששימש היה-180 ° c, מעט מעל נקודת התכה של אתאן (-182.8 ° c). אתה לא צריך לצנן את אתאן liquefier כי זה יכול להיות מקור של היווצרות פרוסט וזיהום של הגביע אתאן. פתח את בקבוק הטוהר הגבוה אתאן שסתום הראשי מאוד לאט לפתוח את וסת הלחץ עד שאתה מקבל ערפל איטי של אתאן. החזק את הזרימה הנמוכה עד שהאתאן הנוזלי בונה. ממלאים את הספל לקצהו העליון. סגור את וסת הלחץ ואת השסתום הראשי של בקבוק אתאן. הסר את הלייקה liquefier בזהירות והשאר אותה בצד על גבי פוליסטירן מוקצף מתחת למכסה המנוע. לשמור על שטח העבודה מכוסה באופן רופף עם כובע פוליסטירן שחור סיפק עם המכונה כדי למנוע זיהום פרוסט של אזור העבודה ואת המיכל אתאן. רק לפני לחיצה ידנית של המדגם, להסיר את הפקק פוליסטירן שחור ומהתפריט של קונסולת לחיצה “התחתון החדר”, אשר מביא את החדר הסביבתי במגע עם שטח העבודה הקריוגני. . היכונו למחוק את הדגימההכן את החוצץ המתאים להסרת עקבות מלחים ממדיום התרבותי. עבור פרוטוקול זה, מאגר אצטט אמוניום שימש לשטיפה התאים מד א-MB-231.הערה: מאגר אצטט אמוניום מתאים לרוב סוגי התאים, והוא אינו מוסיף לאות הזריחה ברנטגן (בהתחשב באלמנטים עם Z > 9). מספר קווי תאים מסוימים, כגון תאים עצביים, עשויים לדרוש שימוש במאגר ייעודי. למשל, עבור נוירונים בקליפת המין העיקרית, פתרון מלוחים המורכב 1.8 נפח של 0.5 M Na2hpo4 ו 1.9 נפח של 0.5 m נה2פו4 ניתן להשתמש15. לעומת זאת, זרחן או כלור הכלולים במאגר יתרום לספקטרום XRF. מגבלה זו של שורות פליטת רנטגן מזויף יש לזכור בהתאם לאלמנטים של עניין להתגלות. הכנת 150 mM אמוניום אצטט הפתרון מ אמוניום אצטט באלקטרופורזה הפתרון ולבדוק pH (7.0-7.3) ו (270 – 300 mosm/ק”ג)הערה: האוסמלאידים שהוזכרו לעיל הוא שווה ערך לתמיסת פוספט של Dulbecco (D-PBS) ללא סידן ומגנזיום וניתן לבדוק אותה באמצעות מיקרו-אוסממטר. למלא את המספר הדרוש של בארות מ 12 צלחת פלסטיק היטב עם מאגר אצטט אמוניום. גזור רבע מסנן נייר לחיתוך, או מנייר מסנן מס ‘ 1 עם חור שנחתך מראש, או מנייר סינון ידני של קוטר 55 מ”מ עם חור מרכזי בגודל 15 מ”מ. קחו את המדגם הנדרש המאוחסן בחממה ב 37 ° c ברגע האחרון לפני שטיפה לצלול-מקפיא את הקרום. לפתוח את הפינצטה באמצעות הטבעת השחורה שחור של מלקחיים לשחרר מהיר (בדרך כלל הטבעת דומונט להדק את מלקחיים רפואי בדיוק גבוהה) ולתפוס את Si3N4 ממברנה תמיכה מהתרבות היטב.הערה: תפוס את באמצע מסגרת הסיליקון, שמירה על קצה הפינצטה ליד הקרום. הזז את התפס השחור למטה אל הפסים הראשונים כדי לנעול את הפינצטה. לטבול את Si3N4 ממברנה תמיכה אנכית בפתרון מאגר אצטט אמוניום שמרו ב 37 ° c עבור ~ 5 s.הערה: על התמיכה להישאר אנכית במאגר. שימו לב כי פתרון המאגר בכל באר של הצלחת יכול לשמש עד שלושה ממברנות לאותו תנאי דגירה. למחוק באופן ידני עם נייר סינון כדי לנקז את המאגר העודף מתוך הפתרון שטיפה הממברנה (איור 4) כדי להשאיר שכבה דקה והומוגנית של הפתרון אמוניום אצטט מימית המכסה את התאים.הערה: כדי לעשות זאת, תחילה לחץ על הישבן של החלון על נייר המסנן כדי להסיר כמעט את כל המאגר מימית נשאר בבאר ובגב הקרום. שנית, למחוק את הצד הקדמי, החל משני צידי הפינצטה, ולאחר מכן כל צד של המסגרת (איור 4). . לעולם אל תיגע בקרום עודף של מאגר סחוט יכול להיות מנוטר עם האוראולה הנוצרת על נייר סינון. פתח את דלת חדר הסביבה ובמהירות לטעון את הפינצטה, החלקה אותו לתוך הלקחיים משתלבים, ולסגור את הדלת (איור 5). לחץ על “כריכה חשופה”. הפינצטה מחזיק את Si3N4 ממברנה יהיה במהירות צלל לתוך הקריוגן. הסר את המכסה של מיכל ההעברה עם מלקחיים מקורר. לחץ על “העברה”. Si3N4 ממברנה יהיה מעט מעלה מעל הקריוגן. בתנועה מהירה אחת, לנתק את הפינצטה על ידי הזזת אותם מתוך מלקחיים משתלבים ולהטות מעט מתוך משתלבים להביא ישירות לתוך חריץ ריק של תיבת ההקפאה במיכל העברת מלא עם LN2. שחררו את טבעת המלחציים השחורה כדי לשחרר את הקרום (איור 5).הערה: על מיכל ההעברה להיות תמיד מכוסה ב-LN2. כאשר נדרש מילוי מלא, לכסות את הגביע אתאן עם מכסה פלסטיק שסופקו עם המכונה כדי למנוע ערבוב LN2 ו-אתאן. כסו את מיכל ההעברה במכסה והשתמשו בספל פוליסטירן לבן קטן שמולא ב-LN2 כדי להעבירו לקופסת פוליסטירן מלאה ב-ln2.הערה: לאחר מכן ניתן לאחסן את המיכל או הצינור המכיל את הקרומים ב-50 mL ממולא ב-LN2 והועברו לאחסון לטווח ארוך ב-2 dewar. לפני שמתחילים להקפיא את הדגימה הבאה, לחמם את כל מלקחיים קר ומזוגג עם מייבש שיער או צלחת חם/קריוכלי מייבש (45 ° c) כדי למנוע זיהום עם גבישי קרח. 5. הקפאת ייבוש של תאים קפואים לצלול על ממברנות סיליקון הנירכוב הערה: לצורך ייבוש הקפאה, השלבים הבאים חלים על תאי מד א-231 ו-HN. כדי לצנן את מייבש ההקפאה, יהיה עליך להמתין בסביבות 40 דקות עד 1 h. הגדרת מייבש ההקפאה הפעל את החשמל עם מתג הנדנדה הממוקם בלוח האחורי של המכשיר. התחל להזין את הפרמטרים הבאים בתפריט LCD: קטע 1 = 2 h ב-120 ° c; פלח 2 = 2 הרמפה מ-120 ° צ’ עד-80 ° צ’; קטע 3 = 2 ח’ ב-80 ° c; פלח 4 = 2 מעלות השיפוע מ-80 ° c עד 50 ° c; פלח 5 = 2 ב-50 ° c; קטע 6 = 6 שיפוע מ50 ° c עד 30 ° c. בתום הגדרת הפרמטרים, שמור את ההגדרות, סגור את המכסה הקאמרי ולחץ על ‘כוכבT’. היחידה תהיה לשאוב עד 1.10-5 mbar. כאשר מגיעים ללחץ זה, שורת הפקודה של התצוגה תציג את “התחל לקרר עכשיו, התחל להמשיך”. למלא את החנקן נוזלי Dewar באופן סדיר כדי לצנן את הבמה מתחת לטמפרטורה הגדרת נקודה משולשת.הערה: טמפרטורת השלב המשולש מוגדרת ל-140 ° c. לפני טעינת המדגם עבור פרוטוקול זה, מומלץ להמתין 1 h ובשלב הטמפרטורה של-160 ° c. הצג יציג “הקש ENTER” כאשר מוכן “לטעון מדגם”. לצנן את הטמפרטורה חנקן נוזלי בתוך LN2 ממולא פוליסטירן dewar, מחזיק העברת המדגם סיפק הספק, ואת שני פליז נוסף גלילי Si3N4 מחזיקי ממברנה. הר את Si3N4 מחזיק פליז ממברנה על גבי מחזיק העברה לדוגמה סיפק הספק בקלקר dewar (איור 6א). שמור את הרמה של LN2 כדי כ 1-2 מ”מ מתחת לקצה העליון של פיסת פליז הראשון. תרימי את Si3N4 ממברנה לדוגמה תמיכה מתוך תיבת הקירור או הצינורית PCR באמצעות מלקחיים לסגירה עצמית מראש inox או טפלון מצופה. הפקדה את הקרום עם התאים לדוגמה בצד כלפי מעלה בחלל הנחושת ממוספרים. כסו את ההרכבה בכלי הפליז השני כמכסה (איור 6ג).הערה: עיצבנו שני דיסקי פליז כל אחד בעל עובי של 5 מ”מ, קוטר של 50 מ”מ, וחור קוטר 11 מ”מ מרכזי. הראשון בדיסק יש 14 מלבני מכונת (8 מ”מ x 6 מ”מ) מיקומים כדי להתאים את התמיכה (5 מ”מ x 5 מ”מ). כל חריץ יש שטוח ומלוטש היטב עם עומק של 2 מ”מ. דיסק הפליז השני הוא שטוח לכסות את התמיכה פליז3N4 ממברנה משמש מארז מלכודת קרה. לצנן את מוט העברת בקופסת קצף ממולא בתוך2 ולהשתמש בו כדי לנעול את ההרכבה המלאה (איור 6D, E). לחץ על “ENTER” בלוח הקדמי של מייבש ההקפאה. משאבות טורבו ורוטרי יפסיקו והחדר מטוהר עם גז חנקן יבש כדי לאפשר פתיחת מכסה החדר. מיד להעביר את ההרכבה לדוגמה הרכבה עם מוט העברה טעון קפיץ לתוך תא מייבש ההקפאה ולהצמיד אותו על הנחושת LN2 בשלב קר.הערה: השאר את ההרכבה המלאה עם מוט ההעברה לתוך התא. סגור מיד את המכסה של תא מייבש ההקפאה ולחץ “כוכבT” כדי להמשיך עם מחזור ייבוש ההקפאה. מלא את מאגר ה-LN2 של מייבש ההקפאה ידנית כל 2 h.הערה: מערכת מילוי אוטומטית של LN2 עשויה להיות מחוברת למאגר זה. בסוף מחזור ההקפאה, לחץ על “STOP” כדי לפרוק את החדר ולהסיר את ההרכבה המלאה כדי לגשת לדגימות ההקפאה.