ثقافة الخلية علي اغشيه نيرايد السيليكون والتعويض عن البرد لل Synchrotron الاشعه السينية الفلورية نانو-تحليل
Summary
ويرد هنا بروتوكول لثقافة الخلية علي الاغشيه نيتريد السيليكون ويغرق-تجميد قبل التصوير الشعاعي الاشعه السينية مع السنكروتروني المبردة الاشعه السينية نانوسبر. عندما يتم توفير درجه حرارة الغرفة فقط نانو التحليل ، يمكن ان تكون العينات المجمدة مزيد من التجميد المجفف. هذه هي الخطوات الحاسمة للحصول علي معلومات حول تكوين عنصري داخل الخلايا.
Abstract
ولا يعرف سوي القليل جدا عن توزيع أيونات المعادن علي المستوي دون الخلوي. ومع ذلك ، فان هذه العناصر الكيميائية لها وظائف تنظيميه أساسيه والتوازن المضطرب وتشارك في مختلف الامراض. الدولة من بين الفن السنكروتروني الاشعه السينية النانو الفلورية توفير الحساسية المطلوبة والدقة المكانية لتوضيح ثنائي الابعاد (2d) وثلاثي الابعاد (3d) توزيع وتركيز المعادن داخل الخلايا بأكملها في مستوي عضيه. وهذا يفتح مجالات علميه جديده مثيره للتحقيق في دور المعادن في الفيزيولوجيا الفسيولوجية للخلية. ويعد الاعداد الخلوي اجراء رئيسيا ومعقدا في كثير من الأحيان ، ولا سيما بالنسبة للتحليل الأساسي. علي الرغم من ان تقنيات الاشعه السينية الآن علي نطاق واسع واستخدمت أساليب الاعداد المختلفة ، والدراسات قليله جدا وقد حققت في الحفاظ علي محتوي عنصري من الخلايا في أحسن الحال ، وليس بروتوكول مفصل متدرج للتعويض عن البرد وقد تم الإفراج عن الخلايا الملتصقة للاشعه السينية النانو الفلورية حتى الآن. هذا هو وصف للبروتوكول الذي يوفر اعداد الخلوية تدريجيا لكريوفيكسيشن السريع لتمكين السنكروتروني الاشعه السينية الشعاعية التحليل نانو الخلايا في حاله رطبه المجمدة عندما تتوفر بيئة المبردة ونقل. في حاله النانو-تحليل يجب ان يؤديها في درجه حرارة الغرفة ، ويتم توفير اجراء إضافي لتجميد التجفيف الاعداد الخلوي كريوفيكسيد. وقد تم استخدام البروتوكولات المقترحة بنجاح في الاعمال السابقة ، ومؤخرا في دراسة التوزيع الثنائي الابعاد والثلاثي الابعاد لمركب فلزي في خلايا سرطان الثدي.
Introduction
المصممة حديثا السنكروتروني الاشعه السينية الفلورية (SR-xrf) النانو تحقيقات تسمح التصور للتوزيع تحت الخلوية من العناصر بطريقه كميه بالبالكامل. وعلي سبيل المثال ، تسمح هذه القدرة التحليلية بالتحقيق في امتصاص جزيئات جسيمات نانويه1 أو فلزي مثل المجمعات المستندة إلى الاوزميوم2، وتوفر نظره ثاقبه علي الامتصاص داخل الخلايا للجسيمات القائمة علي المعادن مع خصائص مضاده للسرطان قويه. كتقنية متعددة العناصر ، يوفر SR-XRF3 مع نانوسبر وسيله لقياس وتعريب اينتراسيلولارلي معظم العناصر الهامه بيولوجيا في وقت واحد ، بما في ذلك الفوسفور والكبريت والبوتاسيوم والكالسيوم والحديد والنحاس والزنك. في الواقع ، فان استخدام الاشعه السينية الصلبة يوفر عمق اختراق كبير للصورة كامله الخلايا المجمدة الرطبة في أزياء خاليه من التسمية. وعلاوة علي ذلك ، وتوفير الوصول إلى الحافة K من معظم عناصر الفائدة ، والاشعه السينية الفلورية هو متحمس أكثر كفاءه. ويسمح استخدام النهج المبردة بالحد من الضرر الإشعاعي والتحسين الأمثل للحفاظ علي هيكل الخلية والتوزيع العنصري.
ومعظم التقنيات التحليلية المتاحة التي تحل مكانيا لدراسة الفلزات في الخلايا هي تقنيات سطحيه تتطلب إنتاج أجزاء رقيقه جدا ومسطحه من الخلايا. ويشمل هذا أساسا مسح المجهر الكترون الإرسال مع تحليل الطاقة التشتت الاشعه السينية (الجذعية-EDX) ، والطاقة المصفاة المجهر الكترون الإرسال (EF-TEM) ، والنانو الثانوية الطيف الكتلة الايونيه (نانوسيمس). لا يمكن اجراء هذا الأخير علي أقسام الخلايا المجمدة والمائية بينما يمكن اجراء تحليل التبريد باستخدام المجهر الكتروني مع دقه مكانيه غير مسبوقة ولكن الحساسية العنصرية الضعيفة. وقد سمحت انبعاثات الاشعه السينية المستحثة بالجسيمات بدراسة التوزيعات العنصرية في الخلايا الكاملة. لديها ميزه كونها كميه تماما مع حساسية عنصري عادله علي مقياس ميكرون وحتى في submicron القرار4، ولكن يعاني من الاضرار الاشعاعيه وعدم وجود قدرات المبردة لدراسة الخلايا المتجمدة الرطب. كل هذه التقنيات التحليلية تكمل بعضها البعض في التصوير العنصري للخلايا ، ولكن بالنسبة لجميع التقنيات ، يعد اجراء اعداد العينات خطوه حاسمه. وينبغي الإبقاء عليه بسيطا للحد من التلوث المحتمل فضلا عن أعاده التوزيع العنصري و/أو التسرب للحصول علي نتائج ذات مغزى. كما هو موضح في المجهر الكتروني ، وسير العمل المبردة ، بما في ذلك تجميد التبريد من الخلية والكريوترانسفير إلى مرحله كرويوكانينج ، يسمح الحفاظ علي عنصري الأمثل في مستويات شبه الخلوية أقرب ما يمكن إلى الدولة الاصليه5،6،7،8،9،10. وقد تم تنفيذ هذا الفهم بنجاح في تطوير المجهرية السينية الاشعه السينية اللينة (علي سبيل المثال ، المجاهر الميدانية الكاملة والمجاهر المسح الضوئي) لإنتاج التصوير الهيكلي الشامل لكامل الخلايا المجمدة الرطب في 2D أو 3D. تم تطوير مهام سير العمل المبردة المختلفة11 لمجاهر الاشعه السينية الناعمة في Beamline 2.1 (XM-2) من مصدر الضوء المتقدم في مختبر لورانس بيركلي الوطني12، beamline U41 في حلقه تخزين الكترون Bessy الثاني (ألمانيا)13، BEAMLINE MISTRAL من مصدر الضوء البا (اسبانيا)14، وفي Beamline B24 من مصدر ضوء الماس15، من بين أمور أخرى. وقد تبين مؤخرا ان سير العمل المماثل هو الطريقة الأكثر موثوقيه للاعداد والحفظ للتحليل العنصري داخل الخلايا باستخدام الاشعه السينية المجهرية16،17.
علي الرغم من ان تقنيات النانو الاشعه السينية بدات تستخدم علي نطاق واسع لتحليل عنصري الخلوية ، وخاصه مع ظهور قدرات المبردة SR-XRF ، لم يتم نشر بروتوكول متدرج حتى الآن إلى المجتمع البحثي. هنا ، يتم توفير اجراء مفصل لاعداد كريوفيكسيد الخلايا الملتصقة المستزرعة كطبقات أحاديه علي اغشيه نيرايد السيليكون ليتم تحليلها في ظل الظروف المبردة. وتقدم أيضا خطوه التجفيف بالتجميد بعد البروتوكول في حاله وجوب اجراء تحليل الاشعه السينية في درجه حرارة الغرفة. في حين تم استخدام البروتوكول المقترح بنجاح مع خلايا سرطان الثدي الإنسان MD-MB-2312 وتم التدليل علي تجميد التجفيف من بين أمور أخرى علي الخلايا العصبية الماوس18،20،21، ويمكن توسيعها بسهوله إلى أنواع مختلفه من الإنسان أو الخلية الحيوانية.
Protocol
Representative Results
Discussion
[برد-الكترون] مجهريه ([برد-م]) يربح ال 2017 [نوبل بريز] في كيمياء وبما ان مثل هذا التطوير يجعل ب [ج.]. [دوبوشت] علي تزجيج من ماده احيائيه ل ال [هيغ-ديكايشن] بنيه تحديد الجزيئات احيائيه في حل25. وكما ذكر دوبوشيت في محاضرته التي ألقاها بجائزه نوبل “ان معرفه كيفيه القيام بالتزجيج لقطره من الماء شيء واحد ، فان اعداد عينه بيولوجية للمراقبة البيولوجية هو آخر”25. وتعتبر الآن خطوات التعويض عن البرد التقنية القياسية للتخفيف من الضرر الناجم عن الجرعة الاشعاعيه ودراسة الخلايا القريبة من حالتها الاصليه. غير ان الاعداد لا يزال مملا. وذلك لان المجهر الكتروني ، نظرا لدقته المكانية غير المسبوقة ، حساس لأي قطعه أثريه بنيوية تحدث اثناء اعداد العينة. وتقترب الآن المجسات المتزامنة من الصعوبات المماثلة التي تنخفض إلى القرارات المكانية بحيث تصل إلى 13 نانومتر في نطاق الاشعه السينية العالية الطاقة26. من الصعب الاشعه السينية المجهر يمكن تحليل الخلايا بأكملها في حين يعاني المجهر الكترون من عمق تغلغل الفقراء من الكترونات تمكين فقط شرائح رقيقه جدا الخلية التي يمكن ملاحظتها.
أحاديه الخلايا هي رقيقه بما يكفي بحيث يغرق-تجميد في الإيثان السائل ، يتم تحقيق معدلات التبريد المطلوبة لتزجيج المياه. من الناحية النظرية ، معدلات التبريد عاليه مثل 108 ك/س ممكنة باستخدام الضغط العالي التجميد27 الذي يسمح التزجيج من العينات سميكه جدا ليغرق تجميد. يتم الوصول إلى معدل تبريد 105 ك/ثانيه ، المطلوبة للسماح بالتزجيج الكامل للعينه في الضغط المحيط28، التكرار باستخدام التلقائي يغرق-تجميد اله والمعلمات المعروضة هنا. وهذا يسمح للباحث بان يرمم العينات البيولوجية الرقيقة (< 10 ميكرومتر) مثل الطبقة الاحاديه من الخلايا12،13،14،15،29،30 بالتجميد في الإيثان السائل.
ومن التحديات الهامه مع هذا البروتوكول هو أيضا الحفاظ علي قدر الإمكان السلامة الكيميائية للمحتوي داخل الخلايا لتوفير توزيعات عنصري موثوق بها في الخلية في 2D أو 3D. كما نشرت في مكان آخر2،16،17،31، في حاله التصوير العنصري علي المستوي تحت الخلوي ، ينبغي النظر في تحليل الخلايا الرطبة المجمدة. والا ، يمكن استخدام مزيج من يغرق-تجميد وتجميد تجفيف الخلايا لتحليل درجه حرارة الغرفة. بالنسبة لهذا الأخير ، يتم أزاله الجليد غير متبلور من خلال عمليه التسامي ، في حين يتم أزاله جزيئات الماء المنضم من خلال عمليه الامتصاص. قد تكون هذه العملية بعيده عن المثالية مقارنه بالعينات الرطبة المجمدة بسبب التغير المحتمل في الاغشيه الخلوية وشكل بعض الهياكل الخلوية32. أيضا ، بالنسبة للدراسات المحددة ، قد يؤدي استخراج المياه إلى قطع أثريه معدنيه. ومع ذلك ، فقد كان ناجحا وأفضل بديل لعينات رطبه المجمدة للتصوير عنصري في المستويات الفرعية 100 nm2،16،17،18،20،33،34،35،36.
كما تم الإبلاغ عن37، ويمكن تقييم نوعيه الاستعدادات الخلوية بالتبريد من خلال نسبه K/Na البوتاسيوم إلى الصوديوم. لسوء الحظ ، فانه لا يمكن حتى الآن ان تحدد مع الصلبة الاشعه السينية نانوسبر المستخدمة هنا ، وذلك بسبب انخفاض الطاقة المنخفضة للكشف عن الانجراف السيليكون المستخدمة للكشف عن الفوتونات الاشعه السينية من العناصر (E ≥ 1.3 كيلو المغنيسيوم). في الواقع ، نسبه عاليه K/Na (> 10) التي يمكن قياسها باستخدام توف-سيمز ، epma ، أو ميكروسبر النووية pixe16،37 هو مؤشر علي سلامه المواد الكيميائية المحفوظة للخلية مقارنه بالمتوقع ك/نا من 25 في خليه حيه37. ويمكن دعم ذلك بنسبه منخفضه من Cl/K المصاحبة38. ومع ذلك ، فان التزجيج الناقص ، خاصه إذا كانت سرعه تبريد العينة منخفضه جدا ، يمكن ان تؤدي إلى تشكيل بلورات جليدية كبيره يمكن ان تتلف اغشيه الخلايا والأرغن ، التالي تغيير توزيع العناصر الكيميائية. علي الرغم من انه لا يوجد اجراء روتيني لمراقبه هذا الضرر المحتمل والتاثير علي التوزيع داخل الخلايا ، فان نسب العنصري المذكورة أعلاه وامكانيه تصوير الخلية بدقه عاليه باستخدام الاشعه السينية المتباينة أو المجهرية السينية بالاشعه السينية يمكن ان تكون أفضل الطرق لدعم الحفاظ علي سلامه المقصورات الجمع بين هذه التقنيات واستخدام المجاهر البصرية كريوكوريلاتيفي مضان المتقدمة حديثا سوف تساعد علي تقييم إلى اي مدي يحدث هذا الضرر ويؤثر علي توزيع عنصري داخل الخلايا.
وعموما ، يتم تقديم بروتوكول مفصل وشامل لاعداد عينات الخلوية لتحليل الاشعه السينية الشعاعية السنكروتروني. وهو نقطه انطلاق جيده للمجتمع البحثي ، مما يساعد علي حل القضية الصعبة لكيفيه اعداد عينات الخلوية المناسبة ل 2D و 3D التصوير العنصري في (البرد) الصلبة الاشعه السينية النانو. ويمكن دمج هذه النهج مع القدرات الضوئية البصرية والمجهرية الكترونيه للتصوير الكيميائي النسبي العميق والتصوير الهيكلي للخلايا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أجريت التجارب علي النانو التصوير beamline ID16A في اطار مقترحات ESRF LS2430 ، LS2303 ، و LS2765.
Materials
| Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O | SIGMA | 09691-250mL | One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway. |
| B27 supplement, 50x | Life Technologies, Invitrogen | 17504-044 | for hippocampal neuron culture |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2) | GIBCO | 14190-094 | cell culture |
| DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification) | GIBCO | 21885025 | cell culture |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Life Technologies, Invitrogen | 31966-02 | for hippocampal neuron culture |
| Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05×0.01mm Tips, Biology | World Precision Instrument | 501202 | |
| Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer | Quorum Technology | EK3147 | |
| Ethane N45 | Air Liquid | p0505s05r0a001 | C2H6 > 99,995 % |
| Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin | GIBCO | A31604-02 | cell culture |
| HBSS 10x | Life Technologies, Invitrogen | 14185-052 | for hippocampal neuron culture |
| Leica GP quick-release forceps | Leica | 16706435 | |
| MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell | ATCC | ATCC HTB-26 | cell culture |
| Neurobasal medium | Life Technologies, Invitrogen | 21103-049 | for hippocampal neuron culture |
| Nunc 4-Well Plate | Thermo Fisher | 176740 | cell culture |
| Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer | Advanced Instruments | Osmo1 | Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO® Vapor Pressure Osmometer) |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | P4333 | cell culture |
| poly-L-lysine | SIGMA | P4707 | Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged). |
| Plunge freezing robot Leica EM GP main unit | Leica | 16706401 | Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing. |
| Silicon nitride membrane (Si3N4) | Silson Ltd. | SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl | The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane…) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco… |
| Trypan blue solution 0.4% | GIBCO | 15250061 | cell culture |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | GIBCO | 25300-054 | cell culture |
| Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water | Fisher Chemicals | W9-1 | MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis. |
| Whatman No. 1 filter paper with precut hole | Leica | 16706440 | Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used. |
References
- Lewis, D. J., et al. Intracellular synchrotron nanoimaging and DNA damage/genotoxicity screening of novel lanthanide-coated nanovectors. Nanomedicine. 5 (10), 1547-1557 (2010).
- Fus, F., et al. The intracellular localization of osmocenyl-tamoxifen derivatives in hormone-independent breast cancer cells revealed by 2D and 3D nano X-ray fluorescence imaging. Angwendte Chemie. , (2019).
- Janssens, K., Adams, F., Rindby, A. . Microscopic X-Ray Fluorescence Analysis. , (2000).
- Carmona, A., et al. Uranium exposure of human dopaminergic cells results in low cytotoxicity, accumulation within sub-cytoplasmic regions, and down regulation of MAO-B. Neurotoxicology. 68, 177-188 (2018).
- Leapman, R. D., Hunt, J. A., Buchanan, R. A., Andrews, S. B. Measurement of low calcium concentrations in cryosectioned cells by parallel-EELS mapping. Ultramicroscopy. 49 (1-4), 225-234 (1993).
- Saubermann, A. J., Echlin, P., Peters, P. D., Beeuwkes, R. Application of scanning electron microscopy to X-ray analysis of frozen hydrated sections. I. Specimen handling techniques. Journal of Cell Biology. 88 (2), 257-267 (1981).
- Saubermann, A. J., Heyman, R. V. Quantitative digital X-ray imaging using frozen hydrated and frozen dried tissue sections. Journal of Microscopy. 146, 169-182 (1987).
- Wroblewski, J., Roomans, G. M. X-ray microanalysis of single and cultured cells. Scanning Electron Microscopy. , 1875-1882 (1984).
- Wroblewski, J., Müller, R. M., Wroblewski, R., Roomans, G. M. Quantitative X-ray microanalysis of semi-thick cryosections. Histochemistry. 77 (4), 447-463 (1983).
- Zierold, K. Cryopreparation of mammalian tissue for X-ray microanalysis in STEM. Journal of Microscopy. 125, 149-156 (1982).
- Harkiolaki, M., et al. Cryo-soft X-ray tomography: Using soft X-rays to explore the ultrastructure of whole cells. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 81-92 (2018).
- McDermott, G., Le Gros, M. A., Knoechel, C. G., Uchida, M., Larabell, C. A. Soft X-ray tomography and cryogenic light microscopy: the cool combination in cellular imaging. Trends in Cell Biology. 19 (11), 587-595 (2009).
- Schneider, G., et al. Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy. Nature Methods. 7 (12), 985-987 (2010).
- Sorrentino, A., et al. MISTRAL: a transmission soft X-ray microscopy beamline for cryo nano-tomography of biological samples and magnetic domains imaging. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (4), 1112-1117 (2015).
- Carzaniga, R., Domart, M. C., Duke, E., Collinson, L. M. Correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray tomography of adherent cells at European synchrotrons. Methods in Cell Biology. 124, 151-175 (2014).
- Perrin, L., Carmona, A., Roudeau, S., Ortega, R. Evaluation of sample preparation methods for single cell quantitative elemental imaging using proton or synchrotron radiation focused beams. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30 (12), 2525-2532 (2015).
- Jin, Q., et al. Preserving elemental content in adherent mammalian cells for analysis by synchrotron-based x-ray fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 265 (1), 81-93 (2017).
- Daoust, A., et al. Impact of manganese on primary hippocampal neurons from rodents. Hippocampus. 24 (5), 598-610 (2014).
- Daoust, A., et al. Manganese Cytotoxicity Assay on Hippocampal Neuronal Cell Culture. Bio-protocol. 5 (1), 1368 (2015).
- Gibon, J., et al. The over-expression of TRPC6 channels in HEK-293 cells favours the intracellular accumulation of zinc. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1808 (12), 2807-2818 (2011).
- Hasna, J., Bohic, S., Lemoine, S., Blugeon, C., Bouron, A. Zinc Uptake and Storage During the Formation of the Cerebral Cortex in Mice. Molecular Neurobiology. , 1-13 (2019).
- Villar, F., et al. Nanopositioning for the ESRF ID16A Nano-Imaging Beamline. Synchrotron Radiation News. 31 (5), 9-14 (2018).
- Kosior, E., et al. Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for subcellular metal quantification. Journal of Structural Biology. 177 (2), 239-247 (2012).
- Bohic, S., et al. Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells. Applied Physics Letters. 78, 3544-3546 (2001).
- Dubochet, J. On the Development of Electron Cryo-Microscopy (Nobel Lecture). Angwendte Chemie. 57 (34), 10842-10846 (2018).
- Da Silva, J. C., et al. Efficient concentration of high-energy X-rays for diffraction-limited imaging resolution. Optica. 4 (5), 492-495 (2017).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high-pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
- Moor, H., Steinbrecht, R. A., Zierold, K. Theory and pratice of high pressure freezing. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , 175-191 (1987).
- Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Journal of Electron Microscopy Techniques. 3 (2), 177-210 (1986).
- Ferreira, J. L., Matthews-Palmer, T. R., Beeby, M. Electron Cryo-Tomography. Cellular Imaging. , 61-94 (2018).
- Colvin, R. A., Jin, Q., Lai, B., Kiedrowski, L. Visualizing metal content and intracellular distribution in primary hippocampal neurons with synchrotron X-ray fluorescence. PLoS One. 11 (7), 0159582 (2016).
- Vavpetič, P., et al. Elemental distribution and sample integrity comparison of freeze-dried and frozen-hydrated biological tissue samples with nuclear microprobe. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 348, 147-151 (2015).
- Guerquin-Kern, J. L., Bordat, C. Cryo-preparation procedures for elemental imaging by sims and eftem. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. , 499-536 (2008).
- Gramaccioni, C., et al. Nanoscale quantification of intracellular element concentration by X-ray fluorescence microscopy combined with X-ray phase contrast nanotomography. Applied Physics Letters. 112 (5), 053701 (2018).
- Perrin, L., et al. Zinc and Copper Effects on Stability of Tubulin and Actin Networks in Dendrites and Spines of Hippocampal Neurons. ACS Chemical Neurosciences. 8 (7), 1490-1499 (2017).
- Ortega, R., et al. α-synuclein over-expression induces increased iron accumulation and redistribution in iron-exposed neurons. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1925-1934 (2016).
- Fartmann, M., et al. Quantitative imaging of atomic and molecular species in cancer cultures with TOF-SIMS and Laser-SNMS. Applied Surface Sciences. 231 (2), 428-431 (2004).
- Pålsgård, E., Lindh, U., Roomans, G. M. Comparative study of freeze-substitution techniques for X-ray microanalysis of biological tissue. Microscopy Research and Techniques. 28 (3), 254-258 (1994).
