Zellkultur auf Siliziumnitridmembranen und Kryovorbereitung für Synchrotron-Röntgenfluoreszenz Nano-Analyse

Experimentelle Verfahren wurden vom Tierpflegeausschuss der Life Sciences Division der CEA (CETEA, A14-006) genehmigt. Sie wurden in Übereinstimmung mit den französischen Rechtsvorschriften und der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaft vom 24. November 1986 (86/609/EWG) durchgeführt. 1. Siliziumnitrid (Si3N4) Membranunterstützungspräparation HINWEIS: Da die Membran zerbrechlich und empfindlich ist, muss ihre Stütze (200 m dicker Siliziumrahmen) schonend gehandhabt werden, idealerweise mit einer dünnen Carbon-Pinzette oder Dumont Pinzette #5, Gerade selbstschließende Feine. Dieses Protokoll verwendete Siliziumnitridmembranen mit einem Rahmen von 5 mm x 5 mm und einer Membrangröße von 1,5 mm x 1,5 mm. Die Membran sollte etwa 12 h vor Beginn des Experiments vorbereitet werden (d.h. Zellsaat). Membranen können am Ende des Tages vorbereitet werden und über Nacht unter einer laminaren Strömungshaube der Klasse II trocknen, so dass sie am nächsten Morgen einsatzbereit sind. Eine Siliziumrahmendicke von 200 m ist Standard für die meisten Unternehmen, die Siliziumnitridfenster verkaufen. Wenn das in diesem Protokoll verwendete Produkt nicht verfügbar ist, kann eine Membrangröße im Bereich von 0,5 bis 1,5 mm mit einer Standardrahmengröße von 5 mm x 5 mm verwendet werden. Die größere Membrangröße wird bevorzugt, wenn Röntgentomographie verwendet wird. TEM Gittertyp Siliziumnitridfenster mit einer Membrangröße von 0,5 mm und einer Dicke von 50 nm können ebenfalls verwendet werden. Öffnen Sie die Kapsel mit der Membranstütze Si3N4 (Abbildung 1). Drücken Sie die Kapsel vorsichtig, um die Stütze leicht zu lösen. Halten Sie eine der Ecken des Silikonrahmens mit der dünnen Pinzette. Achten Sie darauf, die Si3N4 Membran in der Mitte nicht zu berühren. Die 200 oder 500 nm dicke Membran kann leicht beschädigt werden. Mit der dünnen Pinzette, legen Sie die Si3N4 Membranstütze vorsichtig in eine sterile Glas Petrischale, flache Oberfläche des Siliziumnitridfensters nach oben (d. h. den Hohlraum nach oben). Entfernen Sie den Deckel der Petrischale und lassen Sie die Membranen unter UV-Licht für 25-30 min unter dem laminaren Strömungsschrank.HINWEIS: Das UVC-Licht (254 nm) ist in der Regel auf 200 w/cm2eingestellt. Legen Sie 10 l Poly-L-Lysin auf die Membran. Der Tropfen sollte die Si3N4 Membran gut abdecken und kann sich etwas über den Siliziumrahmen ausbreiten. Lassen Sie es bei 37 °C für 25 min im Standard-Gewebekultur-Inkubator bei 100% relativer Luftfeuchtigkeit und 95% Luft, 5%CO2.HINWEIS: In diesem Fall wurde eine Poly-L-Lysin-Beschichtung für die MDA-MB-231 Brustkrebszellen verwendet. Je nach Art der Zelllinie können verschiedene Beschichtungen verwendet werden, und dieser Schritt sollte entsprechend optimiert werden. Füllen Sie in einer sterilen 48-Well-Platte verschiedene Brunnen mit 200 bis 250 l ultrareinem und ultraspurigem Wasser, das durch einen 0,22 m sterilen Filter gefiltert wird. In der Regel kann jeder Brunnen verwendet werden, um bis zu 2-3 Membranen zu spülen. Mit einer feinen Pinzette nehmen Sie die Membranstütze an einer Ecke des Siliziumrahmens auf. Spülen Sie die Membran sanft, indem Sie sie vertikal 10 s in drei aufeinanderfolgenden Brunnen untertauchen.HINWEIS: Die Membranstützen werden aus dem Inkubator entnommen und können bei Raumtemperatur verarbeitet werden, wobei die Temperatur und die Feuchtigkeit durch eine laminare Strömungshaube der Klasse II definiert werden. Die Membranhalterung vertikal in einen leeren Brunnen einer sterilen 96-Wellplatte geben, bedecken und über Nacht unter einer laminaren Strömungshaube der Klasse II trocknen lassen. 2. Zellaussaat In eine sterile 4 Brunnenplatte, legen Sie die Membranen mit ihrer flachen Seite nachoben. MDA-MB-231-Zellen werden in DMEM in einer Monolayer-Kultur mit Phenolrot/Glutamax I gehalten, ergänzt durch 10% fetales Kalbsserum und 1% Penicillin und Streptomycin bei 37 °C in einem 5% CO2-Luftbefeuchter. Wenn die Zellen 60 bis 70 % Koninfluenza erreichen, entfernen Sie das Medium aus der Schale oder dem Kolben. 1x mit 10 ml Phosphatgepufferte Saline von Dulbecco ohne Ca2+ oder Mg2+waschen. Fügen Sie 3 ml/T75 Kolben 0,05% Trypsin/EDTA Lösung hinzu und stellen Sie sicher, dass die gesamte Monoschicht mit der Trypsin-Lösung abgedeckt ist. Inkubieren Sie für 3 x 5 min bei 37 °C, bis sich die Zellen zu lösen beginnen. Es sollte darauf geachtet werden, dass die Zellen nicht übermäßig trypsinisieren und die Zellen nicht dazu zwingen, sich vorzeitig zu lösen. Fügen Sie 8 ml DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Kalbsserum und 1% Penicillin und Streptomycin oder kompletten Medien, hinzu und sammeln Sie die Zellen durch Pipettieren. Das Serum in den Medien neutralisiert das Trypsin. Drehen Sie bei 250 x g für 3 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie den Überstand. Fügen Sie 8 ml frisches Komplettmedium in die 15 ml Tube mit dem Zellpellet und pipet die Zellen nach oben und unten, bis die Zellen in eine Einzelzellsuspension verteilt sind. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und verdünnen Sie auf eine Konzentration von 5 x 106 Zellen pro ml in vollständigen Medien (DMEM mit Phenol Red/1% eines 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptids in 0,85% NaCl-Lösung, ergänzt mit 10% fetalem Kalbsserum und 1% Penicillin und Streptomycin). Nehmen Sie 10 l der MDA-MB-231-Zellsuspension und legen Sie sie auf die Membran ab. Dies entspricht 50.000 Zellen/10 l für MDA-MB-231. Der Tropfen sollte die Si3N4 Membran gut abdecken und kann sich ein wenig auf dem Siliziumrahmen ausbreiten. Es ist darauf zu achten, dass die Membran Si3N4 nicht mit der Spitze der Mikropipette berührt wird.HINWEIS: Je nach Art der Zelllinie und Experimenten oder Messungen kann die Zelldichte variieren und sollte entsprechend getestet werden. Hier wurde die vorgeschlagene Zelldichte für die Aussaat der Si3N4 Membran für die experimentellen Bedingungen und die weitere SR-XRF-Nanoanalyse der MDA-MB-231-Zellen2optimal befunden. Bei Hippocampus-Neuronen (HN) entfernen Sie das Hippocampus-Gehirngewebe von embryonalen 18,5 Mäusen und verdauen Esin in 0,25% Trypsin in Hepes-HBSS (5,3 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 137,9 mM NaCl, 0,34 mM NaH2PO4, 5,56 mM Glukose) bei 37 °C für 15 min18,19. Führen Sie die mechanische Dissoziation mit einer P1000-Pipette mit einer P1000-Spitze und einer P200-Spitze durch, indem Sie den Kegelinhalt mit der Pipette mehrmals zeichnen und freigeben. Achten Sie in diesem Schritt darauf, keine Luftblasen im Medium zu erzeugen, da Luftblasen für Neuronen giftig sind. Warten Sie einige Minuten, bis sich das Aggregat am unteren Rand des Rohres absetzt. Den Überstand, der die dispergierten Zellen enthält, in eine sterile Eppendorfröhre übertragen. Lassen Sie das Kulturmedium mit dem Aggregat 25 l. Zählen Sie die dissoziierten Zellen mit einem Hämozytometer. Isolierte HN-Neuronen werden in einer Konzentration von 7 x 104 Zellen cm-2 auf Poly-L-Lysin (1 mg/ml Poly-L-Lysin)-beschichtete Siliziumnitridmembran plattiert. Nur für Membranen mit HN, inkubieren die Neuronen in der ersten DMEM mit 10% fetalem Rinderserum ergänzt. Ein h nach der Beschichtung von HN in DMEM wird das Medium in neurobasale Beschichtungsmedien (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid in 0,85% NaCl-Lösung und B27-Ergänzung d = 1/50 in Neurobasal verdünnt)18,19geändert. Für die MDA-MB-231-Zellen die Membranstützen 25 min bei 37 °C in den Inkubator (100% relative Luftfeuchtigkeit, 95% Luft und 5% CO2) geben. Dadurch können sich die Zellen absetzen und mit der Ansteckung am Substrat beginnen. Dies kann in Abhängigkeit von der verwendeten Zelllinie angepasst werden. Fügen Sie 1 ml des erforderlichen kompletten Kulturmediums hinzu (DMEM mit Phenol Red/1% eines 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptids in 0,85% NaCl-Lösung, ergänzt mit 10% fetalen Waden 1% Penicillin und Streptomycin) in jedem Brunnen der MDA-MB-231 Zellen, indem die Pipettenspitze gegen die Wand des Kunststoffbrunnens gelegt und das Medium sehr langsam freigesetzt wird, während es die Membran bedeckt. Setzen Sie die Membran vertikal an die Wand der 4 Brunnenplatte, um alle Luftblasen zu entfernen, die in der Brunnenhöhle der Si3N4 Membran gefangen sind (Abbildung 2). Verwenden Sie dazu eine feine Pinzette und schieben Sie die Blase sehr sanft weg, indem Sie sich parallel zum Si3N4 Backside Frame bewegen, um zu vermeiden, dass die Membran berührt und beschädigt wird. Legen Sie die Membran horizontal an der Unterseite des Brunnens zurück und lassen Sie die 4 Wellplatte im Inkubator für die erforderliche Zeit in Abhängigkeit von der Wachstumsrate der verwendeten Zelllinie. Die MDA-MB-231-Zellen wurden über Nacht inkubiert. 3. Behandlung oder mittlere rindes Entfernen Sie das Medium von der 4 Wellplatte. Einmal mit 1 ml PBS-Lösung bei 37 °C abspülen. Entsorgen Sie die PBS und fügen Sie 1 ml warmes komplettes frisches Medium in Gegenwart oder in Abwesenheit (Kontrollen) der gewünschten Behandlung mit einer 1 ml Pipettenspitze hinzu, wodurch die Flüssigkeit sehr langsam an die Wand der Brunnenplatte freigesetzt wird. Die Membran Si3N4 sollte langsam ohne Störungen untergetaucht werden, um Membranbewegungen oder Hebungen zu vermeiden. 4. Kryo-Immobilisierung der zellulären Zubereitung durch HINWEIS: Am Ende der erforderlichen Inkubationszeit müssen die Zellen bei Vorhandensein oder Fehlen einer Behandlung sorgfältig abspült und kryofixiert werden. Etwa 30 min vor dem Abspülen und Abspülen der zellulären Vorbereitung vor dem Einfrieren, erst einstellen und abkühlen die automatische Tauchgefriermaschine. Bei der Manipulation von Kryogenen sind die Verwendung geeigneter kryogener Handschuhe, einer Schutzbrille, geschlossener Schuhe und eines Labormantels erforderlich. Flüssigstickstoff muss in geeigneten Dewars transportiert werden, und der Arbeitsplatz sollte mit einem Sauerstoffmonitor ausreichend belüftet werden. Im Idealfall trägt ein niedriger Hygrometriespiegel von 20 bis 30 % dazu bei, die Eiskontamination der Materialien, Dewars und Kryogene zu begrenzen, was der Verglasung der Proben (d. h. einer amorphen Eisschicht) abträglich ist. Idealerweise können je nach Erfahrungsniveau des Forschers bis zu 10 bis 12 Proben für eine einzelne Sitzung mit dem gleichen sekundären Kryogen-Flüssigethanbecher für die Vitrifizierung vorbereitet werden. Zwischen den Sitzungen erfordert der automatische Tauchgefrierschrank ein 1 h automatisches Backen. Idealerweise sollten Proben mit identischen Inkubationsbedingungen verarbeitet werden. Dennoch können Kontrollen zuerst verarbeitet werden, gefolgt von den Proben mit einer bestimmten Behandlungsbedingung. HINWEIS: Beim Einfrieren des Eintauchens gelten die folgenden Schritte sowohl für MDA-MB-231- als auch für HN-Zellen. Richten Sie den Kryoplunger für eine schnelle Kryofixierung von Zellen ein. Schalten Sie den automatischen Tauchgefrierschrank ein. Geben Sie die Parameter (z. B. Temperatur, prozentuale Luftfeuchtigkeit, Blotting-Zeit, wenn automatisches Blotting verwendet wird, und Position zum Anheben der Probe an die Oberfläche des Kryogens, um den Transfer in einen kryogenen Behälter zu erleichtern) direkt von der Konsole und Parametern ein. Einstellungsmenü. Im vorliegenden Fall wurden die Parameter der Feuchtekammer auf 37 °C und 80 % Luftfeuchtigkeit eingestellt.HINWEIS: Für dieses Protokoll wurden bessere Verglasungsergebnisse und Röntgenaufnahmen mit schneller und sorgfältiger manueller Blotting erzielt. Daher verwendet das Protokoll kein automatisches Blotting-Sequenzprogramm. Befestigen Sie die Luftbefeuchterkammer und füllen Sie sie, um die Feuchtigkeit zu erhalten, zunächst mit einer Spritze mit 60 ml doppelt destilliertem Wasser und dann mit 20 ml, wie auf der automatischen Tauchgefrierkonsole gefordert.HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von Reinstwasser, da es das Verdampfersystem beschädigen kann. Schließen Sie das Ventil und lassen Sie die Schläuche an der Rückseite des Luftbefeuchters befestigt. Installieren Sie den schwarzen Ethanbecher in seinen Halter und bedecken Sie ihn mit den Kunststoffkappen. Füllen Sie den Dewar der Kühlkammer mit LN2und bringen Sie ihn auf die Ebene des Gitters im Arbeitsbereich. Legen Sie eine spezielle Kryo-Box auf, um die Membranen nach der Kryofixation im Transferbehälter am entsprechenden Standort im EM-GP-Arbeitsbereich und in der Nähe des Ethanbecherhalters zu lagern.HINWEIS: Die spezielle Kryo-Box ist eine eigenhausinterne Entwicklung an der Nanoprobe-Beamline ID16A der europäischen Synchrotronstrahlung in Grenoble. Zeichnungen mit Spezifikationen sind auf Anfrage erhältlich (Abbildung 3). Sie können vier gleichzeitig in einem 50 ml konischen Rohr gelagert werden, um es langfristig in einem LN2-Dewar zu lagern. Eine alternative Möglichkeit besteht darin, ein kleines 0,2 ml normales PCR-Dünnwandrohr mit Kuppelkappen zu verwenden, um eine einzelne Si3N4 Membranunterstützung zu speichern. Sie müssen ein 2 mm langes Loch im oberen Teil des Wandrohrs mit einer beheizten Spritzennadel bohren, damit LN2 das Rohr füllen kann. Füllen Sie den Transferbehälter mit LN2 und bedecken Sie ihn mit dem dafür vorgesehenen Aluminiumdeckel. Füllen Sie die Kühlkammer weiterhin mit LN2 (normalerweise werden 2 L benötigt), sodass die LN 2-Level-Monitoranzeige auf der Konsole bei 100 % bleibt. Warten Sie, bis die endgültige erforderliche Temperatur erreicht ist. Entfernen Sie die Kunststoffkappe und bedecken Sie den Ethanbecher mit dem an die Ethanflasche angeschlossenen Verflüssiger. Warten Sie, bis die Temperatur des Ethanbechers auf den Temperatursollwert gleicht. Wenn sie erreicht sind, beginnen Sie mit der Verwendung des sekundären Kryogens (d. h. verflüssigtem Ethan).HINWEIS: Der verwendete Sollwert lag bei -180 °C und damit leicht über dem Ethanschmelzpunkt (-182,8 °C). Sie müssen den Ethan-Verflüssiger nicht vorkühlen, da er eine Quelle der Frostbildung und Kontamination des Ethanbechers sein kann. Öffnen Sie das hochreine Ethanflaschen-Hauptventil und öffnen Sie sehr langsam den Druckregler, bis Sie einen langsamen Ethannebel erhalten. Halten Sie diesen sehr niedrigen Durchfluss, bis sich flüssiges Ethan aufbaut. Füllen Sie den Becher bis zur Oberkante. Schließen Sie den Druckregler und das Hauptventil der Ethanflasche. Entfernen Sie den Leica Verflüssiger vorsichtig und lassen Sie ihn beiseite auf einem kleinen Polystyrolträger unter der Dunstabzugshaube. Halten Sie den Arbeitsbereich lose mit der schwarzen Polystyrolkappe bedeckt, die mit der Maschine geliefert wird, um Frostkontaminationen des Arbeitsbereichs und des Ethanbehälters zu verhindern. Kurz vor dem manuellen Blotgen der Probe entfernen Sie die schwarze Polystyrolkappe und aus dem Menü der Konsolenpresse”Unterkammer”, die die Umweltkammer mit dem kryogenen Arbeitsbereich in Kontakt bringt. Bereiten Sie sich darauf vor, die Probe zu blots.Bereiten Sie den entsprechenden Puffer vor, um Spuren von Salzen aus dem Kulturmedium zu entfernen. Für dieses Protokoll wurde ein Ammoniumacetatpuffer zum Spülen der MDA-MB-231-Zellen verwendet.HINWEIS: Ammoniumacetatpuffer ist für die meisten Zelltypen geeignet und fügt dem Röntgenfluoreszenzsignal nicht hinzu (unter Berücksichtigung von Elementen mit Z > 9). Einige bestimmte Zelllinien wie neuronale Zellen können die Verwendung eines dedizierten Puffers erfordern. Beispielsweise kann für primäre kortikale Neuronen eine saline Lösung verwendet werden, die aus 1,8 Volumen von 0,5 M Na2HPO4 und 1,9 Volumen von 0,5 M NaH2PO4 besteht15. Auf der anderen Seite trägt Phosphor oder Chlor, der im Puffer enthalten ist, zum XRF-Spektrum bei. Diese Begrenzung der fadenscheinigen Röntgenemissionsleitungen muss in Abhängigkeit von den zu erkennenden Elementen im Auge behalten werden. 150 mM Ammoniumacetatlösung aus Ammoniumacetat-Ultrapure-Lösung vorbereiten und auf pH-Wert (7,0–7,3) und Osmolarität (270–300 mOsm/kg) überprüfenHINWEIS: Die oben genannte Osmolarität entspricht der Phosphatpuffer-Saline (D-PBS) von Dulbecco ohne Kalzium und Magnesium und kann mit einem Mikroosmometer überprüft werden. Füllen Sie die erforderliche Anzahl von Brunnen aus einer 12 Brunnenkunststoffplatte mit dem Ammoniumacetatpuffer ein. Schneiden Sie ein Viertel Filterpapier zum Blotgen, entweder aus Filterpapier Nr. 1 mit vorgeschnittenem Loch oder aus manuell gestanztem Filterpapier mit 55 mm Durchmesser mit einem 15 mm Mittelloch. Nehmen Sie die benötigte Probe, die im letzten Moment bei 37 °C im Inkubator gelagert wird, vor dem Spülen und Einfrieren der Membran heraus. Entriegeln Sie die Pinzette mit dem schwarzen Klemmring der Schnellspannzange (typischerweise ein Dumont Spannring hochpräzise medizinische Pinzette) und greifen Sie die Si3N4 Membranunterstützung aus der Kultur gut.HINWEIS: Schnappen Sie sich die Mitte des Silikonrahmens und halten Sie die Spitze der Pinzette in der Nähe der Membran. Bewegen Sie den schwarzen Klemmenring bis zu den ersten Streifen, um die Pinzette zu verriegeln. Tauchen Sie die Si3N4 Membranstütze vertikal in die Ammoniumacetat-Pufferlösung ein, die bei 37 °C für 5 s gehalten wird.HINWEIS: Die Unterstützung sollte vertikal im Puffer bleiben. Beachten Sie, dass die Pufferlösung in jedem Bohrgut der Platte für bis zu drei Membranen für die gleichen Inkubationsbedingungen verwendet werden kann. Mit Filterpapier manuell bübeln, um den überschüssigen Puffer aus der Membranspüllösung abtropfen zu lassen (Abbildung 4), um eine dünne und homogene Schicht aus wässriger Ammoniumacetatlösung zu hinterlassen, die die Zellen bedeckt.HINWEIS: Drücken Sie dazu zuerst die Rückseite des Fensters auf das Filterpapier, um fast den gesamten wässrigen Puffer zu entfernen, der im Brunnen und auf der Rückseite der Membran verbleibt. Zweitens, blot die Vorderseite, beginnend von beiden Seiten der Pinzette, dann jede Seite des Rahmens (Abbildung 4). Berühren Sie niemals die Membran. Der Überschuss des entleerten Puffers kann mit dem auf dem Filterpapier gebildeten Aureole überwacht werden. Öffnen Sie die Umweltkammertür und montieren Sie schnell die Pinzette, schieben Sie sie in die Zangenverriegelung, und schließen Sie die Tür (Abbildung 5). Drücken Sie “Blot/A plunge”. Die Pinzette mit der Membran Si3N4 wird schnell in skryogen getaucht. Entfernen Sie den Deckel des Transferbehälters mit vorgekühlten Zangen. Drücken Sie “Transfer”. Die Si3N4 Membran wird leicht über dem Kryogen nach oben bewegt. Trennen Sie die Pinzette in einer einzigen schnellen Bewegung, indem Sie sie aus der Zangenverriegelung schieben und leicht aus der Verriegelung kippen, um direkt in einen leeren Schlitz der Kryo-Box im mit LN2gefüllten Transferbehälter zu gelangen. Lösen Sie den schwarzen Klemmenring, um die Membran zu befreien (Abbildung 5).HINWEIS: Der Transferbehälter sollte immer mit LN2abgedeckt werden. Wenn eine Nachfüllung erforderlich ist, bedecken Sie den Ethanbecher mit dem mit gelieferten Kunststoffdeckel, um ln2 und Ethan nicht zu mischen. Bedecken Sie den Transferbehälter mit einem Deckel und verwenden Sie einen kleinen weißen Polystyrolbecher, der mit LN2 gefüllt ist, um ihn in eine mit LN2gefüllte Polystyrolbox zu übertragen.HINWEIS: Die Kryo-Box oder Tube, die die Membranen enthält, kann dann in 50 ml konischen Rohren gelagert, die mit LN2 gefüllt sind, und in eine Langzeitlagerung LN2 Dewar übertragen werden. Bevor Sie mit dem Tauchen beginnen, die nächste Probe einfrieren, wärmen Sie alle kalten und gefrosteten Pinzette mit einem Haartrockner oder einem Kochplatten-/Kryowerkzeugtrockner (45 °C) auf, um eine Kontamination mit Eiskristallen zu vermeiden. 5. Gefriertrocknung von tauchgefrorenen Zellen, die auf Siliziumnitridmembranen kultiviert werden HINWEIS: Für die Gefriertrocknung gelten die folgenden Schritte für MDA-MB-231- und HN-Zellen. Um den Gefriertrockner abzukühlen, müssen Sie etwa 40 min bis 1 h warten. Einrichten des Gefriertrockners Schalten Sie das Gerät mit dem Wippschalter auf der Rückseite des Instruments ein. Beginnen Sie mit der Eingabe der Parameter nach dem LCD-Menü: Segment 1 = 2 h bei -120 °C; Segment 2 = 2 h Rampe von -120 °C bis -80 °C; Segment 3 = 2 h bei -80 °C; Segment 4 = 2 h Rampe von -80 °C bis 50 °C; Segment 5 = 2 h bei -50 °C; Segment 6 = 6 h Rampe von -50 °C bis 30 °C. Speichern Sie am Ende der Parametereinrichtung die Einstellungen, schließen Sie den Kammerdeckel und drücken Sie “START”. Das Gerät pumpt bis 1,10-5 mbar. Wenn dieser Druck erreicht ist, zeigt die Befehlszeile des Displays “Starten Sie jetzt ab, START wird fortgesetzt”. Füllen Sie den flüssigen Stickstoff Dewar regelmäßig, um die Stufe unterhalb der Temperatur-Dreifachpunkteinstellung abzukühlen.HINWEIS: Die Stufe dreifachpunkttemperatur ist auf -140 °C eingestellt. Bevor Sie die Probe für dieses Protokoll laden, ist es am besten, etwa 1 h und eine Temperaturstufe von -160 °C zu warten. Das Display zeigt “Drücken Sie ENTER”, wenn Sie bereit sind, “Sample laden”. Kühlen Sie die Temperatur in einem LN2 gefüllten Polystyrol Dewar, dem vom Lieferanten zur Verfügung gestellten Probentransferhalter und den beiden zusätzlichen zylindrischen Si3N4 Membranhaltern aus Messing auf. Montieren Sie den Membranmessinghalter Si3N4 auf den vom Lieferanten im Polystyrol-Dewar bereitgestellten Probentransferhalter (Abbildung 6A). Halten Sie den Pegel von LN2 bis ca. 1 x 2 mm unter der Oberkante des ersten Messingstücks. Nehmen Sie eine Si3N4 Membranprobenunterstützung aus der Kryo-Box oder dem PCR-Rohr mit vorgekühlter selbstschließender Pinzette in Inox oder Teflon-beschichtet auf. Legen Sie die Membran mit der ZellprobeSeite nach oben in der Messinghalter nummerierten Kavität. Bedecken Sie die Baugruppe mit dem zweiten Messingstück als Deckel(Abbildung 6C).HINWEIS: Wir haben zwei Messingscheiben mit einer Dicke von jeweils 5 mm, einem Durchmesser von 50 mm und einem zentralen Loch mit 11 mm Durchmesser entworfen. Die erste Messingscheibe hat 14 gefräste rechteckige (8 mm x 6 mm) Positionen für Stützen (5 mm x 5 mm). Jeder Schlitz hat einen flachen und polierten Brunnen mit einer Tiefe von 2 mm. Die zweite Messingscheibe ist flach, um die Si3N4 Membran Messingträger zu decken und fungiert als Kaltfalle Gehäuse. Kühlen Sie die Transferstange in der LN2 gefüllten Polystyrolschaumbox vor und verriegeln Sie sie in der Vollmontage (Abbildung 6D,E). Drücken Sie “ENTER” auf die Frontplatte des Gefriertrockners. Die Turbo- und Drehpumpen werden anhalten und die Kammer mit trockenem Stickstoffgas gereinigt, um das Öffnen des Deckels der Kammer zu ermöglichen. Die Probentransferbaugruppe mit dem federbelasteten Transferstab sofort in die Gefriertrocknerkammer geben und auf der Kupfer-LN2-Kaltstufe befestigen.HINWEIS: Lassen Sie die volle Montage mit der Transferstange in die Kammer. Schließen Sie sofort den Deckel der Gefriertrocknerkammer und drücken Sie “START”, um den Gefriertrocknungszyklus fortzusetzen. Füllen Sie das LN2 Reservoir des Gefriertrockners alle 2 h manuell auf.HINWEIS: An dieses Reservoir kann ein automatisches LN 2-Füllsystem angeschlossen werden. Am Ende des Gefriertrocknungszyklus drücken Sie “STOP”, um die Kammer zu entlüften, und entfernen Sie die vollständige Baugruppe, um auf die gefriergetrockneten Proben zuzugreifen.