窒化ケイ素膜上の細胞培養とシンクロトロンX線蛍光ナノ分析のための凍結製剤

実験手順は、CEAのライフサイエンス部門(CETEA、A14-006)の動物ケア委員会によって承認されました。彼らは1986年11月24日のフランスの法律と欧州共同体理事会指令(86/609/EEC)に従って実施されました。 1. 窒化ケイ素(Si3N4)膜支持準備 注:膜は壊れやすく繊細なので、その支持(200μm厚いシリコンフレーム)は、理想的には薄いカーボンピンセットまたはデュモンピンセット#5、ストレート自己閉鎖細かい先端で、穏やかに扱う必要があります。このプロトコルは、5 mm x 5 mm のフレームと 1.5 mm x 1.5 mm の膜サイズを持つ窒化ケイ素膜を使用しました。膜は、実験を開始する前に約12時間(すなわち、細胞播種)を調製する必要があります。膜は、一日の終わりに調製することができ、彼らは翌朝を使用する準備ができているので、クラスII層流フードの下で一晩乾燥を残すことができます。シリコンフレームの厚さ200μmは、窒化ケイ素窓を販売するほとんどの企業に標準装備されています。このプロトコルで使用される製品が利用できない場合、0.5-1.5 mmの範囲の膜サイズは5 mm x 5 mmの標準フレームサイズで使用できます。X線断層撮影を使用する場合は、より大きな膜サイズが好ましい。膜サイズ0.5mm、厚さ50nmのTEMグリッド型窒化ケイ素窓も使用できます。 Si3N4膜支持体を含むカプセルを開きます(図1)。サポートを軽く緩めるためにカプセルを軽く絞ります。 薄いピンセットを使用して、シリコンフレームの角の1つを保持します。中央のSi3N4膜に触れないように注意してください。200または500 nmの厚い膜は容易に損傷を受けることができる。 薄いピンセットを使用して、Si3N4膜支持を無菌ガラスペトリ皿に穏やかに置き、シリコン窒化物窓の平らな表面(すなわち、皿の底に面している空洞)を向きます。 ペトリ皿のふたを取り外し、膜を層流キャビネットの下に25~30分間UV光の下に置きます。注: UVC ライト(254 nm)は通常 200 μW/cm2に設定されます。 膜にポリL-リジンを10μL入れます。ドロップは、Si3N4膜をよくカバーする必要があり、シリコンフレーム上に少し広がることができます。標準的な組織培養インキュベーターで相対湿度100%、空気95%、CO2で25分間37°Cにしておきます。注:この場合、MDA-MB-231乳癌細胞にポリL-リジンコーティングを用いた。細胞株の種類に応じて、様々なコーティングを使用することができ、このステップはそれに応じて最適化する必要があります。 滅菌48ウェルプレートで、0.22μmの滅菌フィルターで濾過された超純粋および超微量水の200-250°Lで異なる井戸を充填します。通常、各ウェルは、最大2−3の膜をすすぐために使用することができます。微細ピンセットを使用して、シリコンフレームの隅で膜サポートをピックアップします。3つの連続した井戸に垂直10sを浸して膜を穏やかに洗い流す。注:膜サポートはインキュベーターから取り出され、クラスII層流フードによって定義される温度および湿度と室温で処理することができる。 無菌96ウェルプレートの空の井戸に膜支持体を垂直に入れ、それを覆い、クラスIIの層流フードの下で一晩乾燥させます。 2. 細胞播種 滅菌4ウェルプレートに、膜を平らな側面を上に向けて置きます。 MDA-MB-231細胞は、フェノールレッド/グルタマックスIを用いてDMEMの単層培養中に維持され、5%CO2空気加湿インキュベーターで10%胎児子牛血清と1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを37°Cで補充した。 細胞が60−70%の合流性に達したら、皿またはフラスコからメディアを取り除きます。 Ca2+またはMg2+なしでダルベッコのリン酸緩衝生理食塩分10mlで1xを洗浄します。 0.05%トリプシン/EDTA溶液の3 mL/T75フラスコを追加し、単層全体がトリプシン溶液で覆われていることを確認します。 細胞が剥離し始めるまで37°Cで3−5分間インキュベートする。細胞を過度にトリプシン化せず、細胞を早期に剥離させないように注意する必要があります。 10%胎児の子牛血清と1%ペニシリンとストレプトマイシンまたは完全な媒体を補充したDMEMの8mlを追加し、ピペットによって細胞を収集します。メディア内の血清はトリプシンを中和します。 室温で250 x gで3分間スピンダウンします。上清を吸引する。 細胞ペレットを含む15mlチューブに8mlの新鮮な完全な媒体を加え、細胞が単一の細胞懸濁液に分散するまで細胞を上下にパイプします。 完全な媒体でヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントし、完全な媒体でmLあたり5 x 106細胞の濃度に希釈する(0.85%の胎児子牛血清および1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した0.85%NaCl溶液中の200mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチドのフェノールレッド/1%のDMEM)。 MDA-MB-231細胞懸濁液の10°Lを取り、膜に付着します。これは MDA-MB-231 の場合、50,000 セル/10 μL に相当します。ドロップは、Si3N4膜をよくカバーする必要があり、シリコンフレームに少し広がることができます。マイクロピペットの先端でSi3N4膜に触れないように注意してください。注:細胞株の種類や実験や測定値に応じて、細胞密度が異なる場合があり、それに応じてテストする必要があります。ここで、Si3N4膜を播種するための細胞密度の提案は、MDA-MB-231細胞2の実験条件及びさらにSR-XRFナノ分析に最適であることがわかった。 海馬ニューロン(HN)の場合、胚発生日18.5マウスから海馬脳組織を除去し、ヘペスHBSS(5.3 mM KCl、 0.44 mM KH2PO4, 137.9 mM NaCl, 0.34 mM NaH2PO4, 5.56 mM グルコース) 37 °C で 15 分18,19. P1000チップとP200チップを備えたP1000ピペットを使用し、ピペットで円錐内容を数回描画して放出することにより、機械的解離を行います。このステップでは、気泡はニューロンに有毒であるため、媒体中に気泡を作成しないように注意してください。 骨材がチューブの底に落ち着くまで数分待ちます。 分散した細胞を含む上清を滅菌エッペンドルフ管に移す。凝集体を含む培養培地の~25°Lを残す。 解光した細胞をヘモサイトメーターで数えます。単離されたHNニューロンは、ポリL-リジン(1mg/mLポリ-L-リジン)コーティングされた窒化ケイ素膜上に7 x 104細胞cm-2の濃度でめっきされる。 HNを有する膜に対してのみ、10%の胎児ウシ血清を補充した最初のDMEMでニューロンをインキュベートする。DMEMでHNをめっきした後1時間、培地は神経基底めっき培地(0.85%NaCl溶液中で200mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチド、およびB27サプリメントd=1/50をニューロバサルで希釈)18、19に変更する。 MDA-MB-231細胞の場合、膜支持体をインキュベーター(相対湿度100%、空気95%、CO25%)で37°Cに25分間入れます。これにより、細胞が沈着し、基板に付着し始める。これは、使用する細胞株に応じて適応され得る。 必要な完全培養培地の1 mLを追加する(フェノールレッド/1%の200 mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチドを10%胎児で補充したNaCl溶液中のDMEM 子牛血清および1%ペニシリンおよびストレプトマイシン)は、プラスチックウェルの壁にピペット先端を置き、膜を覆っている間に媒体を非常にゆっくりと放出することによって、MDA-MB-231細胞の各ウェルに。 膜を4ウェルプレートの壁に垂直に置き、Si3N4膜の井戸腔に閉じ込められた気泡を取り除きます(図2)。これを行うには、細かいピンセットを使用し、非常に穏やかに泡を押し出し、膜に触れたり損傷を与えたりしないように、Si3N4の裏面フレームに平行に移動します。 膜をウェルの底部に水平に戻し、使用する細胞株の増殖速度に応じて必要な時間、4ウェルプレートをインキュベーターに残します。MDA-MB-231細胞を一晩インキュベートした。 3. 治療または中程度の変化 4ウェルプレートから培地を取り出します。 37°Cで1mLのPBS溶液で1回すすす。PBSを廃棄し、1 mLピペットチップを使用して所望の処理の存在または不在(コントロール)で温めた完全な新鮮な媒体の1 mLを追加し、井戸プレートの壁に対して非常にゆっくりと液体を放出します。Si3N4膜は、膜の動きや持ち上げを避けるために、妨害なくゆっくりと水没する必要があります。 4. 突発凍結による細胞製剤のクライオ固定化 注:必要なインキュベーション時間の終わりに、治療の有無において、細胞は慎重にすすり、凍結されなければならない。約30分前に、プランジ凍結の前に細胞製剤をすすいでブロットし、最初にセットアップし、自動プランジマシンを冷却します。極低温を操作する場合は、適切な極低温手袋、安全メガネ、クローズドシューズ、実験室コートの使用が必要です。液体窒素は適切なDewarsで輸送する必要があり、作業場所は酸素モニターの存在と十分に換気する必要があります。理想的には、20−30%の低湿度レベルは、サンプル(すなわち、非晶質氷層)のガラス化に有害である材料、デューワーズ、および凍結原の氷汚染を制限するのに役立ちます。理想的には、研究者の経験レベルに応じて、1つのセッションで最大10−12サンプルを、同じ二次クライオゲン液体エタンカップを使用して調製することができます。セッション間では、自動プランジ冷凍庫には1時間の自動ベークアウト手順が必要です。理想的には、サンプルは同一のインキュベーション条件で処理する必要があります。それでも、コントロールは最初に処理でき、その後に特定の治療条件を持つサンプルが続きます。 注: プランジフリーズの場合、次の手順は MDA-MB-231 または HN セルの両方に適用されます。 細胞の急速な凍結のためにクライオプランジャーを設定します。 自動プランジ冷凍庫をオンにします。 パラメータ(温度、湿度パーセント、自動ブロッティングを使用する場合はブロッティング時間、極低温容器への転送を容易にするためにサンプルをクライオゲンの表面に持ち上げる位置など)をコンソールとパラメータから直接入力します。設定メニュー。本例では、湿度室のパラメータを37°C及び湿度80%に設定した。注:迅速かつ慎重な手動ブロッティングを使用して、このプロトコルとX線イメージングのためにより良いガラス化結果が得られました。したがって、プロトコルは自動ブロッティングシーケンスプログラムを使用しません。 加湿器室を取り付け、湿度を保つために、まず60mLの二重蒸留水を使用してそれを満たし、次に自動プランジ冷凍庫コンソールで求めのある20 mLを使用します。メモ:気化器システムに損傷を与える可能性があるため、超純水の使用は避けてください。バルブを閉じ、加湿器の裏側にチューブを取り付けたままにします。 黒いエタンカップをホルダーに取り付け、プラスチックキャップで覆います。 LN2で冷たい部屋のデュワーを埋め、作業領域内のグリッドのレベルにそれを持って来ます。 EM-GP作業領域の専用の場所に保持され、エタンカップホルダーの近くに保持された転写容器に凍結後に膜を格納するために専用のクライオボックスを置きます。注:専用のクライオボックスは、グルノーブルのヨーロッパ放射光のナノプローブビームラインID16Aでの社内開発です。仕様の図面は、ご要望に応じてご利用いただけます(図3)。それらはLN2デュワーの長期貯蔵のための50 mL円錐形の管で一度に4つ貯えることができる。別の可能性は、単一のSi3N4膜支持体を格納するためにドームキャップ付きの小さな0.2 mL規則的なPCR薄い壁管を使用することである。LN 2がチューブを充填できるようにするには、加熱された注射針を使用して壁管の上部に〜2mmの穴を開ける必要があります。 転写容器にLN2を充填し、専用のアルミ蓋で覆います。コンソールの LN2レベルモニタディスプレイを 100% に保つ LN2 (通常は ~2 L が必要) でコールドチャンバーを埋め続けます。最終的に必要な温度に達するまで待ちます。 プラスチックキャップを取り外し、エタンボトルに接続された液化剤でエタンカップを覆います。エタンカップの温度が温度設定値に平衡化するまで待ちます。到達したら、二次凍結ゲン(すなわち、液化エタン)の使用を開始する。注:使用したセットポイントは-180°Cで、エタン融点(-182.8°C)をわずかに上回った。それはエタンカップの霜の形成と汚染の源となり得るので、エタン液化剤を予冷する必要はありません。 高純度のエタンボトルメインバルブを開き、エタンのゆっくりとした霧が得られるまで圧力レギュレータを非常にゆっくりと開きます。液体エタンが蓄積するまで、この非常に低い流れを保ちます。カップを上端までいっぱいにします。圧力レギュレータとエタンボトルのメインバルブを閉じます。ライカ液化剤を慎重に取り外し、ヒュームフードの下の小さなポリスチレンサポートに置いておきます。作業領域とエタン容器の霜汚染を防ぐために、機械に付属の黒いポリスチレンキャップで作業領域を緩く覆っておいてください。 サンプルの手動ブロッティングの直前に、黒いポリスチレンキャップを取り外し、コンソールプレス「下房」のメニューから、極低温の作業領域に接触して環境室をもたらします。 サンプルをブロットする準備をします。培養培地から塩の痕跡を除去するのに十分な緩衝液を準備します。このプロトコルには、酢酸アンモニウム緩衝液をMDA-MB-231細胞のリンスに用いた。注:酢酸アンモニウム緩衝液は、ほとんどの細胞タイプに適しており、蛍光X線信号には添加しません(Z>9の元素を考慮)。神経細胞のようないくつかの特定の細胞株は、専用の緩衝液の使用を必要とし得る。例えば、一次皮質ニューロンの場合、0.5MNa2HPO4の1.8体積および0.5M NaH2PO4の1.9体積からなる生理線溶液を15個使用することができる。一方、緩衝液に含まれるリンまたは塩素は、XRFスペクトルに寄与する。スプリアスX線放出ラインのこの制限は、検出される対象の要素に応じて留意する必要があります。 酢酸アンモニウム超純度溶液から150mMの酢酸アンモニウム溶液を調製し、pH(7.0~7.3)と浸透圧(270~300mM/kg)を確認注:上記の浸透圧は、カルシウムとマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS)に相当し、マイクロオストメータを使用して確認することができます。 酢酸アンモニウムバッファーで12ウェルプラスチックプレートから必要な数の井戸を記入してください。 プレカット穴が付いた1番フィルターペーパーから、または15mmの中央穴を持つ直径55mmの手動パンチングフィルターペーパーから、ブロッティング用の4分の1のフィルターペーパーをカットします。 リンスし、膜を突っ込む前に、最後の瞬間に37°Cでインキュベーターに保存された必要なサンプルを取り出します。 クイックリリース鉗子(通常はデュモンクランプリング高精度医療ピンセット)の黒クランプリングを使用してピンセットのロックを解除し、培養からSi3N4膜サポートをつかみます。メモ:シリコンフレームの中央をつかみ、ピンセットの先端を膜の近くに保ちます。黒いクランプリングを最初のストライプに下に移動して、ピンセットをロックします。 Si3N4膜支持体を酢酸アンモニウム緩衝液に垂直に浸漬し、37°Cで~5sに保たれます。注: サポートはバッファ内で垂直のままにする必要があります。なお、プレートの各ウェルにおける緩衝液は、同じインキュベーション条件に対して最大3つの膜に使用することができる。 フィルターペーパーで手動でブロットし、膜リンジング溶液(図4)から余分な緩衝液を排出し、細胞を覆う酢酸アンモニウム水溶液の薄く均質な層を残すために。メモ:これを行うには、まず窓の裏側を濾紙に押して、井戸と背面に残っているほぼすべての水性緩衝液を取り除きます。次に、ピンセットの両側から始めて前面をブロットし、次にフレームの両側をブロットします(図4)。膜に触れないでください。排水されたバッファの過剰は、濾紙上に形成されたアウレオールで監視することができる。 環境室のドアを開き、ピンセットを素早く取り付け、鉗子のインターロックにスライドさせ、ドアを閉じます(図5)。 「ブロット/Aプランジ」を押してください。Si3N4膜を保持するピンセットは、すぐに凍結原に突っ込みます。 予冷鉗子で搬送容器のふたを取り外します。 「転送」を押します。Si3N4膜は、凍結原の上にわずかに上に移動します。 単一のクイックムーブメントでは、鉗子のインターロックからそれらをスライドさせてピンセットを取り外し、インターロックからわずかに傾けて、LN2で満たされた転送コンテナ内のクライオボックスの空のスロットに直接持ち込みます。黒いクランプリングを放して膜を解放します(図5)。注 : 転送コンテナは常に LN2で覆う必要があります。補充が必要な場合は、LN2とエタンの混合を避けるために、機械に付属のプラスチック蓋でエタンカップを覆います。 転写容器を蓋で覆い、LN2で満たされた小さな白いポリスチレンカップを使用して、LN2で満たされたポリスチレンボックスに移します。注:膜を含むクライオボックスまたはチューブは、LN2で満たされた50 mL円錐形チューブに保存し、長期保存LN2デュワーに移すことができます。次のサンプルを凍結し始める前に、氷の結晶との汚染を避けるために、ヘアドライヤーまたはホットプレート/クライオツールドライヤー(45°)ですべての冷たく曇ったピンセットを温めます。 5. 窒化ケイ素膜上で培養したプランジ凍結細胞の凍結乾燥 メモ:凍結乾燥の場合、MDA-MB-231細胞とHN細胞の両方に以下の手順が適用されます。凍結乾燥機を冷却するには、約40分から1時間待つ必要があります。 凍結乾燥機の設定 機器の背面パネルにあるロッカースイッチで電源を入れたり、電源を入れたりつきます。 LCDメニューに続くパラメータの入力を開始します: セグメント 1 = -120 °C で 2 h;セグメント 2 = -120 °C から -80 °C までの 2 h ランプ;セグメント 3 = -80 °C で 2 時間;セグメント 4 = -80 °C から 50 °C までの 2 h ランプ;セグメント 5 = -50 °C で 2 時間;セグメント 6 = -50 °C から 30 °C までの 6 h ランプ。 パラメータの設定の最後に、設定を保存し、チャンバーのふたを閉じて”START”を押します。 単位は1.10-5 mbarまでポンプでくみ上げる。この圧力に達すると、ディスプレイのコマンドラインに「今すぐ冷却を開始し、START」と表示されます。 液体窒素デュワーを定期的に充填し、温度トリプルポイント設定以下のステージを冷却します。メモ:ステージトリプルポイント温度は-140°Cに設定されています。このプロトコルのサンプルをロードする前に、約1時間と-160°Cの温度段階を待つのが最善です。 “読み込みサンプル” の準備ができたら、”ENTERキーを押す” と表示されます。 LN2充填ポリスチレンデュワー内の液体窒素温度、サプライヤーが提供するサンプル転写ホルダー、および2つの追加真鍮円筒形Si3N4膜ホルダーに冷却します。 ポリスチレンデュワーのサプライヤーが提供するサンプル転写ホルダーの上にSi3N4膜真鍮ホルダーを取り付けます(図6A)。LN2のレベルを最初の真鍮片の上端より約1−2mm下に保ちます。 イノックスまたはテフロンコーティングされた予冷された自己閉鎖ピンセットを使用して、クライオボックスまたはPCRチューブからSi3N4膜サンプルサポートをピックアップします。 真鍮ホルダー番号の空洞に上を向いた細胞サンプル側で膜を堆積させます。 2枚目の真鍮片をふたとしてアセンブリを覆います(図6C)。注:厚さ5mm、直径50mm、直径11mmの中央11mmの穴を持つ2枚の真鍮ディスクを設計しました。最初の真鍮ディスクはサポート(5 mm x 5 mm)を収容するために14機械化された長方形(8 mm x 6 mm)の位置を有する。各スロットは平らで、2 mmの深さでよく磨かれています。2番目の真鍮ディスクはSi3N4膜真鍮サポートをカバーするために平らであり、コールドトラップエンクロージャとして機能する。 LN2充填ポリスチレンフォームボックスの転写ロッドを予冷し、それを使用して完全なアセンブリにロックします(図6D,E)。 凍結乾燥機の前面パネルにある「ENTER」を押します。 ターボおよび回転ポンプは停止し、チャンバーは部屋のふたを開くことを可能にするために乾燥した窒素ガスで部屋をパージする。 すぐにスプリングロードされたトランスファーロッドでサンプル転写アセンブリを凍結乾燥機室に移し、銅LN2コールドステージでクリップします。メモ:転写ロッドを持つ完全なアセンブリをチャンバーに残します。 すぐに凍結乾燥室のふたを閉じ、「START」を押して凍結乾燥サイクルを続行します。 凍結乾燥機のLN2貯蔵所を2時間ごとに手動で満タンにします。メモ:自動LN2充填システムは、この貯蔵所に接続されている場合があります。 凍結乾燥サイクルの終了時に、STOPを押してチャンバーを通し、完全なアセンブリを取り外して凍結乾燥サンプルにアクセスします。