JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Silikon Nitrür Membranları ve Synchrotron X-ışını Floresan Nano-Analizi için Kriyopreyeüzerine Hücre Kültürü

Published: December 10, 2019
doi:
10.3791/60461
, , , , , ,
1Inserm, UA7, Synchrotron Radiation for Biomedicine (STROBE),Université Grenoble Alpes, 2ID16A Beamline,ESRF, The European Synchrotron

Summary

Burada silikon nitrür membranlar ve dalma-donma bir senkrotron kriyojenik X-ışını nanoprobun ile X-ışını floresan görüntüleme öncesinde hücre kültürü için bir protokoldür. Sadece oda sıcaklığında nano-analiz yapıldığında, dondurulmuş numuneler daha da dondurularak kurutulabilir. Bunlar hücre içi element bileşimi hakkında bilgi edinmek için kritik adımlardır.

Abstract

Hücre altı düzeyde metal iyonlarının dağılımı hakkında çok az şey bilinmektedir. Ancak, bu kimyasal elementler temel düzenleyici işlevleri var ve rahatsız homeostaz çeşitli hastalıklara karışılır. Son teknoloji senkrotron X-ışını floresan nanoprobları, tüm hücrelerdeki metallerin iki boyutlu (2D) ve üç boyutlu (3D) dağılımını ve konsantrasyonunun açıklığa kavuşturması için gerekli hassasiyeti ve mekansal çözünürlüğü sağlar. organel düzeyi. Bu hücrenin fizyopatoloji metallerin rolü üzerinde araştırma yeni heyecan verici bilimsel alanlar açar. Hücresel hazırlık, özellikle temel analiz için önemli ve genellikle karmaşık bir işlemdir. X-ışını floresan teknikleri artık yaygın ve çeşitli hazırlık yöntemleri kullanılmış olmasına rağmen, çok az çalışma en iyi hücrelerin elementer içeriğinin korunması araştırılmış ve kriyoprepres için hiçbir adım salk›rayrıntılı protokol X-ışını floresan nanoprobları için yapışık hücreler şimdiye kadar serbest bırakıldı. Bu, kriyojenik bir ortam ve aktarım mevcut olduğunda dondurulmuş sulu durumdaki hücrelerin senkrotron X-ışını floresannano analizini sağlamak için hızlı cryofixation için adım adım hücreli hazırlık sağlayan bir protokol açıklamasıdır. Nano-analizin oda sıcaklığında yapılması gerektiği durumlarda, kriyofixed yapışık hücresel preparatın dondurulması için ek bir prosedür sağlanır. Önerilen protokoller önceki çalışmalarda başarıyla kullanılmıştır, en son meme kanseri hücrelerinde bir organometalik bileşiğin 2D ve 3D hücre içi dağılımının incelenmesinde.

Introduction

Yeni tasarlanmış senkrotron X-ışını floresansı (SR-XRF) nanoprobları, elementlerin hücre altı dağılımının tamamen nicel bir şekilde görüntülenmesine olanak sağlar. Örnek olarak, bu analitik yeteneği nano tanecikleri alımının araştırılmasını sağlar1 veya osmiyum bazlı kompleksleri gibi organometalikmoleküllerin 2, güçlü antikanser özellikleri ile metal bazlı moleküllerin hücre içi alımı içine fikir sağlayan. Çok elementli bir teknik olarak, sr-xrf3 nanoprobukle aynı anda hesaplamak ve fosfor, kükürt, potasyum, kalsiyum, demir, bakır ve çinko gibi hücre içi en önemli elementleri lokalize etmek için bir yol sağlar. Gerçekten de, sert X-ışınlarının kullanımı etiketsiz bir şekilde tüm dondurulmuş sulu hücreleri görüntü için büyük penetrasyon derinliği sağlar. Ayrıca, ilgi en unsurların K-kenarına erişim sağlayan, X-ışını floresan en verimli heyecan verici. Kriyojenik yaklaşımların kullanımı radyasyon hasarının azaltılmasına ve hücre yapısının ve elementdağılımının korunmasına olanak sağlar.

Hücrelerdeki metalleri incelemek için mekansal olarak çözülen analiz tekniklerinin çoğu, hücrelerin çok ince ve düz bölümlerinin üretilmesi gereken yüzey teknikleridir. Bu esas enerji dağılımlı X-ışını analizi (STEM-EDX), enerji filtreli iletim elektron mikroskobu (EF-TEM) ve nano ölçekli ikincil iyon kütle spektrometresi (nanoSIMS) ile tarama iletim elektron mikroskobu kapsar. Kriyo-analiz, elektron mikroskobu ile eşsiz uzamsal çözünürlük tesbit ivedi ama zayıf elementduyarlılığı ile yapılabiliriken, dondurulmuş, sulu hücre kesitlerinde ikincisi yapılamaz. Parçacık kaynaklı X-ışını salınımı (PIXE) tüm hücrelerdeki elementdağılımlarının incelenmesine olanak sağlamıştır. Mikron ölçeğinde ve hatta submikron çözünürlüğünde4′te adil bir elementsel hassasiyetle tamamen kantitatif olma avantajına sahiptir, ancak radyasyon hasarı ve dondurulmuş susuz hücreleri incelemek için kriyojenik yeteneklerin eksikliğinden muzdaripdir. Tüm bu analitik teknikler hücrelerin elemental görüntülemesinde birbirini tamamlar, ancak tüm teknikler için örnek hazırlama prosedürü çok önemli bir adımdır. Anlamlı sonuçlar elde etmek için olası kontaminasyonun yanı sıra elementel yeniden dağıtım ve/veya sızıntıyı sınırlamak için basit tutulmalıdır. Elektron mikroskobunda gösterildiği gibi, hücrenin kriyo-immobilizasyonu ve kriyotransfer gibi kriyojenik iş akışı, hücre altı seviyelerde mümkün olduğunca yakın olan5,6,7,8,9,10. Bu anlayış, dondurulmuş susuzlu hücrelerin 2D veya 3Boyutlu ultrayapısal görüntülemesini üretmek için senkrotron kriyo-yumuşak X-ışını mikroskobu (örneğin, tam alan mikroskopları ve tarama mikroskopları) geliştirilmesinde başarıyla uygulanmıştır. Çeşitli kriyojenik iş akışları11 Beamline 2.1 (XM-2) Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı12Gelişmiş Işık Kaynağı yumuşak X-ışını mikroskoplar için geliştirilmiştir , elektron depolama halkası BESSY II (Almanya)13, ALBA ışık kaynağının beamline MISTRAL (İspanya)14, ve Beamline B24 Elmas ışık kaynağı15arasında, diğerleri arasında. Benzer bir iş akışı son zamanlarda X-Ray mikroprobları16,17kullanarak hücre içi elementanalizi için en güvenilir hazırlık ve koruma yöntemi olduğu gösterilmiştir.

X-ışını nanoprob teknikleri hücresel elementanalizi için yaygın olarak kullanılmaya başlanmış olsa da, özellikle kriyojenik SR-XRF yeteneklerinin ortaya çıkmasıyla, araştırma topluluğuna şimdiye kadar hiçbir adımsal protokol yayılmıştır. Burada, kriyojenik koşullarda analiz edilecek silikon nitrür membranlarında monolayers olarak kültürlenen kriyofixed yapışık hücrelerin hazırlanması için ayrıntılı bir prosedür sağlanmaktadır. Protokolden sonra uygulanacak bir dondurma-kurutma adımı nda oda sıcaklığında x-ışını analizi yapılması gerekmektedir. Önerilen protokol başarıyla insan meme kanseri hücreleri MD-MB-2312 ile kullanılan ve dondurulma fare nöronlar18,20,21diğerleri arasında gösterilmiştir iken, kolayca insan veya hayvan hücrelerinin çeşitli genişletilebilir.

Protocol

Deneysel prosedürler CEA Yaşam Bilimleri Bölümü (CETEA, A14-006) hayvan bakım komitesi tarafından onaylandı. Bunlar, 24 Kasım 1986 tarihli Fransız mevzuatı ve Avrupa Topluluğu Konseyi Direktifi (86/609/EEC) uyarınca yürütülmüştür. 1. Silikon nitrür (Si3N4) membran destek hazırlama NOT: Membran kırılgan ve hassas olduğundan, desteği (200 μm kalınlığında silikon çerçeve) ince karbon cımbız veya Dumont Cımbız #5, Düz Kendinden kapanan ince ipuçları ile ideal olarak, hafifçe ele alılmalıdır. Bu protokolde 5 mm x 5 mm çerçeveli ve 1,5 mm x 1,5 mm membran boyutunda silikon nitrür membranlar kullanılmıştır. Membran deneye başlamadan önce yaklaşık 12 saat (yani hücre tohumlama) hazırlanmalıdır. Membranlar günün sonunda hazırlanabilir ve bir sonraki sabah kullanıma hazır olmaları için Sınıf II laminar akış başlığı altında bir gecede kurumaya bırakılır. Silikon nitrür pencereleri satan çoğu şirket için 200 μm’lik silikon çerçeve kalınlığı standarttır. Bu protokolde kullanılan ürün mevcut değilse, 0,5−1,5 mm aralığında bir membran boyutu 5 mm x 5 mm standart çerçeve boyutunda kullanılabilir. X-ışını tomografisi kullanıldığında daha büyük membran boyutu tercih edilir. 0,5 mm membran boyutunda ve 50 nm kalınlığında TEM ızgara tipi silikon nitrür pencereler de kullanılabilir. Si3N4 membran desteği içeren kapsülü açın (Şekil 1). Desteği hafifçe gevşetmek için kapsülü hafifçe sıkın. İnce cımbızkullanarak silikon çerçevenin köşelerinden birini tutun. Merkezdeki Si3N4 membrana dokunmamaya dikkat edin. 200 veya 500 nm kalınlığındaki membran kolayca zarar görebilir. İnce cımbızları kullanarak, Si3N4 membran desteğini steril cam petri kabına, silikon nitrür penceresinin düz yüzeyine (yani kabın dibine bakan boşluğu) nazikçe yerleştirin. Petri kabının kapağını çıkarın ve membranları UV ışığı altında laminar akış dolabının altında 25−30 dakika bekletin.NOT: UVC ışığı (254 nm) genellikle 200 μW/cm2olarak ayarlanır. Membrana 10 μL poli-L-lizin koyun. Damla Iyi Si3N4 membran kapsayacak ve silikon çerçeve üzerinde biraz yayılabilir. Standart doku kültürü kuluçka makinesinde 0 bağıl nem ve hava, %5 CO2ile 37 °C’de 25 dakika bekletin.NOT: Bu durumda MDA-MB-231 meme kanseri hücreleri için poli-L-lizin kaplama kullanılmıştır. Hücre hattının türüne bağlı olarak çeşitli kaplamalar kullanılabilir ve bu adım buna göre optimize edilmelidir. Steril 48 kuyu plakasında, farklı kuyuları 0,22 m steril filtreden filtrelenmiş 200−250 μL ultra saf ve ultra iz su ile doldurun. Tipik olarak, her kuyu 2−3 membrana kadar durulama için kullanılabilir. İnce cımbız kullanarak, silikon çerçevesinin bir köşesindeki membran desteğini alır. Membranı dikey olarak 10 s’yi art arda üç kuyuya batırarak hafifçe durulayın.NOT: Membran destekleri kuvözden çıkarılır ve Oda sıcaklığında, Sınıf II laminar akış başlığı ile tanımlanan sıcaklık ve nem ile işlenebilir. Membran desteğini steril 96 kuyuplakasının boş bir kuyusuna dikey olarak yerleştirin, üzerini kapatın ve Sınıf II laminar akış başlığı altında bir gecede kurumasını bekleyin. 2. Hücre tohumlama Steril 4 kuyu plaka, yukarı bakan düz tarafı ile membranlaryerleştirin. MDA-MB-231 hücreleri DMEM’de tek katmanlı bir kültürde fenol kırmızısı/Glutamax I ile, fetal baldır serumu ve %1 penisilin ve streptomisin ile 37 °C’de %5 CO2 hava nemlendirilmiş inkübatörde muhafaza edilir. Hücreler −70’e ulaştığında ortam bulaşık veya şişeden çıkarın. 1x’i 10 ml Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su yla Ka2+ veya Mg2+olmadan yıkayın. %0,05 trypsin/EDTA çözeltisi 3 mL/T75 şişesi ekleyin ve tüm monokatmanın trypsin çözeltisi ile kaplı olduğundan emin olun. Hücreler kopmaya başlayana kadar 37 °C’de 3−5 dk kuluçkaya yatırın. Hücreleri aşırı trypse değil ve erken ayırmak için hücreleri zorlamak değil dikkatli olunmalıdır. fetal baldır serumu ve %1 penisilin ve streptomisin veya komple ortam ile takviye edilmiş 8 ml DMEM ekleyin ve pipetleme ile hücreleri toplayın. Ortamdaki serum tripsini nötralize edecek. Oda sıcaklığında 3 dk için 250 x g aşağı spin. Süpernatant aspire. Hücre peletini içeren 15 ml’lik tüpe 8 ml taze tam ortam ekleyin ve hücreler tek bir hücre süspansiyonuna dağılana kadar hücreleri yukarı ve aşağı borulayın. Hücreleri tam ortamda mL başına 5 x 106 hücre konsantrasyonuna kadar seyreltici olarak sayın (200 mM L-alanyl-L-glutamin dipeptidin in fenol kırmızısı/1% ile DMEM% 0.85 NaCl çözeltisi% 10 fetal buzağı serumu ve% 1 penisilin ve streptomisin ile desteklenmiştir). MDA-MB-231 hücre süspansiyonunun 10 μL’sini alın ve membrana yatırın. Bu, MDA-MB-231 için 50.000 hücre/10 μL’ye karşılık gelir. Damla Iyi Si3N4 membran kapsayacak ve silikon çerçeve üzerinde biraz yayılabilir. Mikropipetin ucu ile Si3N4 membrana dokunmamaya özen gerekir.NOT: Hücre hattının türüne ve deneylere veya ölçümlere bağlı olarak hücre yoğunluğu değişebilir ve buna göre test edilmelidir. Burada, Si3N4 membran tohumlama için önerilen hücre yoğunluğu deneysel koşullar ve MDA-MB-231 hücrelerin in daha fazla SR-XRF nano-analiz için optimal bulundu2. Hipokampal nöronlar için (HN), embriyonik gün hipokampus beyin dokusu kaldırmak 18.5 fareler ve Hepes-HBSS% 0.25 tripsin içinde sindirmek (5.3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4,137.9 mM NaCl, 0.34 mM NaH2PO4, 5.56 mM glikoz) 37 °C’de 15 dk18,19. P1000 ucu ve P200 ucu olan bir P1000 pipet kullanarak, koni içeriğini pipetle birkaç kez çizerek ve serbest bırakarak mekanik dissosilasyon gerçekleştirin. Hava kabarcıkları nöronlar için toksik olduğundan, bu adım sırasında, orta hava kabarcıkları oluşturmak için dikkatli olun. Toplam tüpün altına yerleşene kadar birkaç dakika bekleyin. Dağılmış hücreleri içeren süpernatantı steril bir Eppendorf tüpüne aktarın. Toplam içeren kültür ortamı ~ 25 μl bırakın. Hemositometre kullanarak ayrışmış hücreleri say. İzole HN nöronlar poli-L-lizin (1 mg/mL poli-L-l-lizin) kaplı silikon nitrür membranüzerinde 7 x 104 hücre cm-2 konsantrasyonunda kaplanır. Sadece HN’li membranlar için, ilk DMEM’deki nöronları fetal sığır serumu ile desteklendirin. Bir h DMEM HN kaplama sonra, orta nörobazal kaplama medya (200 mM L-alanyl-L-glutamin dipeptide 0.85% NaCl çözeltisi olarak değiştirilir, ve B27 ek d = 1/50 Neurobasal seyreltilmiş)18,19. MDA-MB-231 hücreleri için, membran desteklerini 25 dakika boyunca kuvözde 37 °C’ye (0 bağıl nem, hava ve %5 CO2)koyun. Bu hücrelerin yerleşmek ve substrat eklemeye başlamak sağlar. Bu, kullanılan hücre hattına bağlı olarak uyarlanabilir. Gerekli komple kültür ortamının 1 mL’sini ekleyin (200 mM L-alanyl-L-glutamin dipeptidin fetal ile desteklenen %0,85 NaCl çözeltisinde Fenol Kırmızısı/%1’i Fenol Kırmızısı olan DMEM buzağı serumu ve %1 penisilin ve streptomisin) MDA-MB-231 hücrelerinin her kuyununda pipet ucunu plastik kuyunun duvarına dayanarak ve membranı kaplarken çok yavaş bir şekilde ortayı serbest bırakarak. Si3N4 membranın kuyu boşluğunda sıkışmış hava kabarcıklarını uzaklaştırmak için membranı 4 kuyu plakasının duvarına dikey olarak yerleştirin(Şekil 2). Bunu yapmak için, ince cımbız kullanın ve çok hafifçe kabarcık itmek, Si3N4 arka çerçeve ye paralel hareket dokunmadan ve membran zarar önlemek için. Membranı yatay olarak kuyunun dibine yerleştirin ve kullanılan hücre hattının büyüme hızına bağlı olarak 4 kuyu plakasını kuvözde bekletin. MDA-MB-231 hücreleri bir gecede kuluçkaya yatırıldı. 3. Tedavi veya orta değişim Orta yı 4 kuyu plakasından çıkarın. 37 °C’de 1 mL PBS çözeltisi ile bir kez durulayın. PBS atın ve varlığında veya yokluğunda (kontroller) 1 mL pipet ucu kullanarak istenilen tedavi 1 mL ısıtılmış tam taze orta 1 mL ekleyin, çok yavaş kuyu plaka duvarına karşı sıvı serbest. Si3N4 membran, membran hareketini veya kaldırmayı önlemek için herhangi bir rahatsızlık olmadan yavaşça batırılmalıdır. 4. Dalma-donma ile hücresel hazırlık kriyo-immobilizasyon NOT: Gerekli kuluçka süresinin sonunda, tedavinin varlığında veya yokluğunda, hücrelerin dikkatlice durulanması ve kriyosabitlenmeleri gerekir. Yaklaşık 30 dakika önce durulayın ve dalma donma önce hücresel hazırlık leke, ilk kurulum ve otomatik dalma dondurucu makine soğutun. Kriyojenleri manipüle ederken, uygun kriyojenik eldiven, güvenlik gözlüğü, kapalı ayakkabı ve laboratuvar paltosu kullanımı gereklidir. Sıvı nitrojen uygun Dewars taşınmalıdır ve çalışma yeri yeterince bir oksijen monitörü varlığı ile havalandırılmalıdır. İdeal olarak, −30’luk düşük higrometri seviyesi, numunelerin vitrifikasyonu için zararlı olan malzemelerin, Dewars’ların ve kriyojenlerin buz kontaminasyonunu sınırlamaya yardımcı olur (yani, amorf bir buz tabakası). İdeal olarak, araştırmacının deneyim düzeyine bağlı olarak, tek bir seans için 10−12’ye kadar numune vitrifikasyon için aynı ikincil kriyojen sıvı etan kabı kullanılarak hazırlanabilir. Seanslar arasında, otomatik dalma dondurucu 1 saat otomatik fırın-out prosedürü gerektirir. İdeal olarak, numuneler aynı kuluçka koşulları ile işlenmelidir. Yine de, kontroller ilk olarak işlenebilir, ardından belirli bir tedavi koşuluna sahip numuneler de işlenebilir. NOT: Dalma-dondurma için aşağıdaki adımlar hem MDA-MB-231 veya HN hücreleri için geçerlidir. Hücrelerin hızlı cryofixation için kriyodoförü ayarlayın. Otomatik dalma dondurucuyu açın. Parametreleri (örn. sıcaklık, yüzde nem, otomatik lekelenme kullanılıyorsa blotlama süresi ve kriyojenik bir kapa transferi kolaylaştırmak için numunenin kriyojen yüzeyine kaldırılması için konum) doğrudan konsoldan ve parametrelerden girin ayarlar menüsü. Bu durumda nem odasının parametreleri 37 °C ve nem olarak belirlenmiştir.NOT: Bu protokol ve x-ışını görüntülemesi için hızlı ve dikkatli manuel blotlama ile daha iyi vitrifikasyon sonuçları elde edildi. Bu nedenle, protokol otomatik bir lekeleme sırası programı kullanmaz. Nemlendirici haznesini takın ve nemi korumak için önce 60 mL çift distile su ile bir şırınga kullanarak doldurun, sonra otomatik dalma dondurucu konsolunda belirtildiği gibi 20 mL.NOT: Buharlaştırıcı sisteme zarar verebileceğinden ultra saf su kullanmaktan kaçının. Vanayı kapatın ve hortumu nemlendiricinin arka tarafına bağlı bırakın. Siyah etan bardağını tutucuya takın ve üzerini plastik kapaklarla kapatın. LN2ile soğuk oda dewar doldurun , çalışma alanı içinde ızgara seviyesine getirerek. EM-GP çalışma alanında ve etan bardak tutucuyakın özel konumda tutulan transfer konteynerinde cryofixation sonra membranlar saklamak için özel bir kriyo-kutu koyun.NOT: Özel kriyo-box Grenoble Avrupa senkrotron radyasyon nanoprobe ışın hattı ID16A bir in-house geliştirme. Teknik özelliklere sahip çizimler istek üzerine mevcuttur (Şekil 3). LN2 Dewar’da uzun süreli depolama için 50 mL konik tüpte bir seferde dört kez saklanabilirler. Alternatif bir olasılık tek bir Si3N4 membran desteği saklamak için kubbe kapakları ile küçük bir 0.2 mL düzenli PCR ince duvar tüpü kullanarak oluşur. LN 2’nin tüpü doldurması için ısıtmalı şırınga iğnesi kullanarak duvar tüpünün üst kısmında~2 mm’lik bir delik açmanız gerekir. Transfer kabını LN2 ile doldurun ve üzerini özel alüminyum kapakla kapatın. Soğuk hazneyi Konsoldaki LN2 seviye monitör ekranını 0 tutarak LN2 (genellikle ~2 L gereklidir) ile doldurmaya devam edin. Gerekli son sıcaklığa ulaşılana kadar bekleyin. Plastik kapağı çıkarın ve etan şişebağlı sıvılaştırıcı ile etan fincan kapağı. Etan bardağının sıcaklığı sıcaklık ayar noktasına gelene kadar bekleyin. Ulaşıldığında, ikincil kriyojenkullanmaya başlayın (yani, sıvılaştırılmış etan).NOT: Kullanılan ayar noktası -180 °C, etan erime noktasının biraz üzerinde (-182.8 °C). Etan likörü önceden soğutmanız gerekmez, çünkü etan kabının don oluşumu ve kirlenmesinin kaynağı olabilir. Yüksek saflıkta etan şişesi ana vanasını açın ve yavaş bir etan sisi elde edene kadar basınç regülatörü çok yavaş bir şekilde açın. Sıvı etan birikimleri kadar bu çok düşük akışı tutun. Bardağı üst kenarına doldurun. Basınç regülatörü ve etan şişesinin ana vanasını kapatın. Leica sıvılaştırıcıyı dikkatlice çıkarın ve duman kaputunun altındaki küçük polistiren desteğinde bir kenara bırakın. Çalışma alanını ve etan konteynerinin don kirlenmesini önlemek için makineyle birlikte sağlanan siyah polistiren kapakla gevşek bir şekilde kapalı tutun. Numunenin manuel olarak lekelenmesinden hemen önce, siyah polistiren kapağını veçevre odasını kriyojenik çalışma alanıyla temas eden konsol basınının menüsünden çıkarın. Örneği lekelemek için hazırlanın.Kültür ortamından tuz izlerini gidermek için yeterli tampon hazırlayın. Bu protokol için MDA-MB-231 hücrelerinin durulanmasında amonyum asetat tamponu kullanıldı.NOT: Amonyum asetat tamponu çoğu hücre tipi için uygundur ve X-ışını floresan sinyaline eklemez (Z > 9’lu elementler göz önüne alınarak). Nöronal hücreler gibi bazı özel hücre hatları özel bir tampon kullanımını gerektirebilir. Örneğin, primer kortikal nöronlar için 0,5 M Na2HPO4 ve 1,9 hacim 0,5 M NaH2PO4 1,8hacimden oluşan bir tuzlu çözelti kullanılabilir 15 . Öte yandan, tampon da bulunan fosfor veya klor XRF spektrumuna katkıda bulunacaktır. Sahte X-ışını emisyon hatlarının bu sınırlaması tespit edilecek ilgi unsurlarına bağlı olarak akılda tutulmalıdır. Amonyum asetat ultrasaf çözeltisinden 150 mM amonyum asetat çözeltisi hazırlayın ve pH (7.0-7.3) ve ozmolarite (270-300 mOsm/kg) olup yokNOT: Yukarıda bahsedilen ozmolarite Kalsiyum ve magnezyum içermeyen Dulbecco fosfat tampon salinine (D-PBS) eşdeğerdir ve mikro-osmometre kullanılarak kontrol edilebilir. Amonyum asetat tamponile 12 kuyu plastik plaka dan kuyuların gerekli sayıda doldurun. Lekeleme için filtre kağıdının dörtte birini, ya önceden kesilmiş bir delikli 1 numaralı filtre kağıdından veya 15 mm merkezi delikli 55 mm çapındaki elle delinmiş filtre kağıdından kesin. Membranı durulamadan ve dondurandan önce son anda 37 °C’de kuvözde saklanan gerekli numuneyi çıkarın. Hızlı salınımlı forceps siyah kelepçe halkası kullanarak cımbız kilidini (genellikle bir Dumont sıkma halkası yüksek hassasiyetli tıbbi cımbız) ve iyi kültürden Si3N4 membran desteği kapmak.NOT: Cımbızın ucunu membrana yakın tutarak silikon çerçevenin ortasını tutun. Cımbızı kilitlemek için siyah kelepçe halkasını ilk şeritlere doğru hareket ettirin. Si3N4 membran desteğini ~ 5 s için 37 °C’de tutulan amonyum asetat tampon çözeltisinde dikey olarak batırın.NOT: Destek arabellekte dikey kalmalıdır. Plakanın her kuyudaki tampon çözeltisinin aynı kuluçka koşulları için en fazla üç membran için kullanılabileceğini unutmayın. Hücreleri kaplayan ince ve homojen bir amonyum asetat tabakası bırakmak için zar durulama çözeltisinden(Şekil 4)fazla tamponu boşaltmak için filtre kağıdı ile elle blot layın.NOT: Bunu yapmak için, önce pencerenin arka tarafına filtre kağıdına bastırarak kuyuda ve membranın arka tarafında kalan neredeyse tüm sulu arabelleği çıkarın. İkinci olarak, cımbızın her iki yanından başlayarak ön tarafı, daha sonra çerçevenin her iki yanından başlayarak blot (Şekil 4). Asla zara dokunma. Boşaltılan tampon fazlalığı filtre kağıdında oluşan aureole ile izlenebilir. Çevre odası nın kapısını açın ve cımbızları hızlıca edin, çerkeslerin birbirine keneğine kaydırın ve kapıyı kapatın(Şekil 5). Basın “Blot/A dalma”. Si3N4 membrantutan cımbız hızla kriyojen içine daldı olacaktır. Önceden soğutulmuş forceps ile transfer kabının kapağını çıkarın. Basın “Transfer”. Si3N4 membran biraz kriyojen üzerinde yukarı hareket ettirilecektir. Tek bir hızlı hareketle, cımbızları forceps kilitlerinden kaydırarak ve ln2ile dolu transfer kabındaki kriyo kutusunun boş bir yuvasına doğrudan getirmek için kilitten hafifçe dışarı doğru eğilerek bağlantıyı bırakın. Membranı serbest bırakmak için siyah kelepçe halkasını serbest bırakın (Şekil 5).NOT: Aktarım kabı her zaman LN2ile kaplanmalıdır. Bir dolum gerektiğinde, LN2 ve etan karıştırma önlemek için makine ile sağlanan plastik kapak ile etan fincan kapağı. Transfer kabını bir kapakla kapatın ve LN2 ile doldurulmuş küçük beyaz polistiren bir fincan kullanın ve LN2ile dolu bir polistiren kutuya aktarın.NOT: Membranları içeren kriyo kutusu veya tüp, LN2 ile doldurulmuş 50 mL konik tüplerde saklanabilir ve uzun süreli bir depolama LN2 Dewar’a aktarılabilir. Bir sonraki numuneyi dondurmaya başlamadan önce, buz kristalleri ile kirlenmeyi önlemek için tüm soğuk ve buzlu cımbızları saç kurutma makinesi veya sıcak plaka/kriyotabur kurutucu (45 °C) ile ısıtın. 5. Silikon nitrür membranlar üzerinde kültürlenmiş dalma-dondurulmuş hücrelerin dondurulması-kurutma NOT: Dondurulma-kurutma için hem MDA-MB-231 hem de HN hücreleri için aşağıdaki adımlar geçerlidir. Donma kurutma makinesini soğutmak için 40 dk ila 1 saat beklemeniz gerekir. Dondurma kurutucuyu ayarlama Göstergenin arka panelinde bulunan rocker anahtarı ile gücü açın. LCD menüsünden sonraki parametreleri girmeye başlayın: -120 °C’de Segment 1 = 2 saat; Segment 2 = -120 °C’den -80 °C’ye kadar 2 h rampa; Segment 3 = 2 h -80 °C’de; Segment 4 = -80 °C’den 50 °C’ye kadar 2 h rampa; Segment 5 = 2 saat -50 °C;; Segment 6 = 6 h rampa -50 °C ile 30 °C arasındadır. Parametre kurulumunun sonunda, ayarları kaydedin, oda kapağını kapatın ve “START” tuşuna basın. Ünite 1,10-5 mbar’a kadar pompalanacaktır. Bu basınca ulaşıldığında, ekranın komut satırında “Şimdi Soğutmaya Başla, DEVAM ETMEYE BAŞLA” gösterecektir. Sıcaklık üç nokta ayarı altında sahne soğutmak için sıvı nitrojen Dewar düzenli doldurun.NOT: Kademe üç puan sıcaklığı -140 °C olarak ayarlanır. Bu protokol için numuneyi yüklemeden önce, yaklaşık 1 saat ve -160 °C sıcaklık evresi beklemek en iyisidir. Ekranda ” EnTERTuşuna Basın” hazır olduğunda “Load sample” gösterecektir. LN2 dolu polistiren Dewar, tedarikçi tarafından sağlanan numune transfer tutucusu ve iki ek pirinç silindirik Si3N4 membran tutucu içinde sıvı nitrojen sıcaklığına kadar soğutun. Si3N4 membran pirinç tutucuyu, polistiren Dewar’da tedarikçi tarafından sağlanan numune transfer tutucunun üzerine monte edin (Şekil 6A). LN2 seviyesini ilk pirinç parçanın üst kenarının yaklaşık 1−2 mm altında tutun. Inox veya teflon kaplı önceden soğutulmuş kendi kendine kapanan cımbızları kullanarak kriyo-box veya PCR tüpbir Si3N4 membran örnek desteği alın. Membranı pirinç tutucu numaralı kaviteye bakan hücre örneği tarafıyla tevdi edin. Montajı kapak olarak ikinci pirinç parça ile kapatın(Şekil 6C).NOT: Her biri 5 mm kalınlığında, 50 mm çapında ve merkezi 11 mm çapında bir delik olan iki pirinç disk tasarladık. İlk pirinç disk, destekleri (5 mm x 5 mm) barındıracak 14 adet işlenmiş dikdörtgen (8 mm x 6 mm) konuma sahiptir. Her yuva 2 mm derinliğe sahip düz ve cilalı bir kuyuya sahiptir. İkinci pirinç disk Si3N4 membran pirinç destek kapsayacak şekilde düz ve soğuk bir tuzak muhafaza olarak görür. LN2 dolu polistiren köpük kutusunda transfer çubuğu precool ve tam montaj kilitlemek için kullanabilirsiniz(Şekil 6D,E). Dondurma kurutucunun ön paneline “ENTER” tuşuna basın. Turbo ve döner pompalar duracak ve oda kuru azot gazı ile temizlenecek odanın kapağının açılmasına izin verilecek. Numune transfer tertibatıile numune transfer tertibatını hemen dondurucu kurutucu odasına aktarın ve bakır LN2 soğuk sahne üzerinde kırpın.NOT: Transfer çubuğu ile tüm montajı odaya bırakın. Donma kurutma odasının kapağını hemen kapatın ve dondurma-kurutma döngüsüne devam etmek için “START” tuşuna basın. Dondurma kurutucunun LN2 haznesini her 2 saatte bir manuel olarak doldurun.NOT: Otomatik LN2 dolum sistemi bu rezervuara bağlanabilir. Dondurma-kurutma döngüsünün sonunda, odayı havalandırmak için ” STOP”tuşunabasın ve dondurulmuş kurutulmuş numunelere erişmek için tam tersini çıkarın.

Representative Results

Donmuş sulu MDA-MB-231 hücrelerinin poli-L-lizin kaplı Si3N4 membran desteğinin alt kültürlenmiş tipik optik video mikroskop görünümü Şekil 7A’dagösterilmiştir. Vakum odasındaki numunenin optik görünümü, ESRF22’ninID16A ışın hattının özel çevrimiçi video mikroskobu kullanılarak yansıma modunda elde edildi. Elektron veya yumuşak X-ışını mikroskobu, hücreyi yerleştiren buz tabakasının mümkün olduğunca ince olmasını gerektirirken (tipik olarak 10 keV) çok daha yüksek penetrasyon derinliği ve daha düşük doz birikimi avantajına sahiptir. Bu nedenle buz kalınlığı daha büyük olabilir, tipik olarak <10 μm hücre de dahil olmak üzere böylece hücre gömme buz kalınlığı birkaç μm olduğunu. Bu, 500 nm kalınlığındaki Si3N4 membranın emilimi dikkate alınarak, numunesiz yoğunlukla karşılaştırıldığında iletimdeki ölçülen X-ışını yoğunluğu ile tahmin edilebilir. Bu buz kalınlığı, mevcut protokolde açıklandığı gibi manuel lekeleme yoluyla elde edilebilir. Newton halkaları bölgesinde, buz kalınlığı daha da ince olabilir (ölçülmez). Dondurulmuş sulu hücrenin X-ışını floresan elementeşer haritalaması Şekil 7B’de potasyum (K), kükürt (S) ve çinko (Zn) gibi fizyolojik elementlerin temsili dağılımları ile gösterilmiştir. Bu haritalar elemental areal kütlesini (yani elementel yansıtılan kütleyi) temsil eder. Bu durumda yapılmazken, bu tür haritalar örnek öngörülen kitle23tahmin sağlayan X-ışını yayılım tabanlı faz kontrast görüntüleme ile normalize edilebilir. Birçok çalışma tarafından bildirildiği gibi, onların yakın yerli devlet korunmuş hücrelerde son derece diffusible K iyon homojen tüm hücre23,24,16boyunca dağıtılan olduğu kabul edildi . Şekil 7B’deki2B X-ışını floresan elementi görüntülerinde gösterildiği gibi, sıkıca bağlanmış S elementi hücre içinde, K’ye benzer şekilde eşit olarak dağıtılmış ve hücresel kitle profilinin iyi bir tahminini temsil eder. Zn dağılımının çekirdeğinde sitosoldan daha yüksek bir sinyal vardı ve çekirdeği açıkça özetledi. Bu küçük Zn zenginleştirilmiş bölgeler nükleer bölgede mekansal çözünürlük (50 nm) tespit edilebilir unutulmamalıdır. Mevcut X-ışını nanoprobları veya inşa edilecek olanlar mutlaka kriyojenik yetenekleri barındırmaz. Bu durumda, alt-100 nm mekansal çözünürlüklerde hücrelerin X-ışını floresan görüntüleri almak için en iyi alternatif hücre dalma-dondurma sonra bu protokolde açıklanan bir dondurma-kurutma işlemi gerçekleştirmektir. Şekil 8A, si3N4 membranüzerinde doğrudan kültürlenmiş, dondurularak kurutulmuş birincil fare hipokampal nöronların tipik bir parlak alan mikroskobu görünümünü gösterir. Bu durumda, temiz bir kurutulmuş odada saklanırsa, numuneler 1−2 hafta önceden hazırlanabilir ve ilgi alanlarının kaydı için sıradan bir dik optik mikroskopla gözlemlenebilir. Dondurularak kurutulmuş numune tarafından yakalanıp X-ışını nanoışının altında hasara yol açabileceğinden ortam nemine maruz kalmamaya özen denilmelidir. Bu işlem çok hassas hücrelere (yani nöronal hücrelere) başarıyla uygulandı ve kanser hücreleri gibi diğer daha sağlam hücre tipleriyle daha iyi sonuçlar elde edildi. Dalma-dondurulmuş hücreler gelince, Tüm dondurulmuş kurutulmuş hücre ekranında K, S ve Zn X-ışını floresan görüntüleri yukarıda açıklananlara benzer. 50−100 nm uzamsal çözünürlükte çeşitli dondurulmuş kurutulmuş hücrelerde bulunan elementdağılımlarını temsil ederler. Tüm hücreleri dondurma elementer bütünlüğünü korumak için bir alternatif olsa da, hücre morfolojisi16mükemmel bir koruma pahasına , özellikle hücre zarları. Şekil 1: X-ışını floresans nano-analizi için tipik örnek destek. Koruyucu kapsülünde Si3N4 membran desteği. Bu tip substrat hem oda sıcaklığı analizi (düşük sıcaklık ve düşük vakum dondurma-kurutma işlemi takip dalma-dondurma hücresel hazırlık) veya kriyojenik X-ışını floresan analizi için kullanılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Hücre tohumlama dan sonra silikon nitrür pencerelerin şematik görünümü. Hücreler doğrudan Si3N4 membran desteğinin poli-L-lizin kaplı düz yüzeyine kültürlenir. Bazen hava kabarcıkları Si3N4 membran desteğinin arka boşluğunda sıkışıp olabilir ve protokolde açıklandığı gibi kaldırılması gerekir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: In-house sıvı azot Dewar dalma dondurulmuş Si3N4 membran destekler uzun vadeli depolama için 3D baskılı kriyo-box geliştirdi. (A) Kriyo-kutu konteyner ve kapaklar (alt kısmı) ve (B)kilitli kapaklar ile monte kriyo-kutu ile sökülmüş. Kapaklar cımbızla manipüle edilebilir, dönüşle açılabilir veya kilitlenebilir. ESRF ID16A’nın isteği üzerine 3D yazdırma için ayrıntılı bir plan mevcuttur. Tasarım silikon nitrür TEM ızgaraları karşılamak için yapılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Si3N 4’te kültürlenmiş hücrelerin blotlama. Önce dalma-dondurma hücre monolayer üzerine kültürlü bir Si3N4 membran amonyum asetat çözeltisi içinde durulanmalıdır(A) ve dikkatle filtre kağıdı kullanılarak lekeli (B). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Otomatik dalma-donma EM-GP makine. (A) Otomatik dalma dondurucu. (B) Cımbızkilitli çevre odası. (C) Etan bir şişebağlı Leica sıvılaştırıcı ile kaplı etan fincan. (D) Sıvılaştırılmış etan dolu siyah fincanı ve vitrifiye Si3N4 membranların LN2’sinde daha fazla depolama için kriyo-kutuyu gösteren dalma-dondurma muhafazası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: Dondurma-kurutma işlemi için örnek kriyotransfer montajı. (A) Si3N4 membranlar için ilk pirinç alıcı, dondurucu alıcı tedarikçisi tarafından sağlanan numune transfer tutucunun üzerine monte edilir. (B) ve (C) ikinci düz pirinç diskin kapak olarak kullanıldığını ve dondurucu kurutucunun vakum kasasına yerleştirilmesi için soğuk bir tuzak muhafazası görevi görür. (D) Yay yüklü transfer çubuğu ile tam montaj. (E) Si3N4 membran üzerinde yetiştirilen vitrifiye hücresel preparattaşıyan numune tutucu ln2soğutmalı dondurma kurutucuya daha fazla yerleştirilmelidir. Montaj montaj için tüm adımlar LN2 bir Strafor kutusunda yapılır. Netlik için, tüm görüntüler LN yokluğunda üretildi2. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: Sert X-ışını nanoprobumu kullanarak donmuş sulu bir hücrenin kriyo-X-ışını floresan görüntüleri. (A) ESRF ID16A ışın hattının özel optik video mikroskobu kullanılarak yansıma modunda tipik çevrimiçi görünüm. Manuel blotlamadan sonra, dondurulmuş sulu hücrelerin net bir şekilde görüntülenebilen toplam 5−10 m buz kalınlığı elde edildi. Newton halkaları ile bir bölge bile çok daha ince buz göstergesi fark edilir. (B) Fizyolojik elementlerin potasyum (K), kükürt (S) ve çinko (Zn) temsili kriyo-X-ışını floresan hücresel dağılımları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 8: Sert X-ışını nanoprobumu kullanarak dondurulmuş nöronal hücrenin x-ışını floresan görüntüleri. (A) Ortaya çıkan dondurularak kurutulmuş primer kortikal nöronal hücrelerin tipik parlak alan mikroskobu görünümü doğrudan Si3N4 membran üzerine kültürlü. Ölçek çubuğu = 200 μm(B) Temsili oda sıcaklığında tek bir dondurulmuş kurutulmuş hipokampal nöron fizyolojik elementlerin potasyum (K), kükürt (S) ve çinko (Zn) dağılımlarını gösteren X-ışını floresan görüntüleri. Ölçek çubuğu = 2 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) 2017 Nobel Kimya Ödülü’nü kazandı ve j. Dubochet tarafından biyolojik malzemenin vitrifikasyonu üzerine yapılan gelişme25. Dubochet’in Nobel dersinde bildirdiği gibi “Bir su damlasını nasıl vitrife ediş edeyim bilmek başka bir şeydir, biyolojik gözlem için biyolojik bir örnek hazırlamak başka bir şeydir”25. Kriyohazırlık adımları artık radyasyon dozu hasarı azaltmak ve kendi yerel durumuna yakın çalışma hücreleri için standart teknik olarak kabul edilir. Ancak hazırlık sıkıcı olmaya devam ediyor. Bunun nedeni elektron mikroskopisinin, emsalsiz uzamsal çözünürlüğü nedeniyle, numune hazırlama sırasında oluşan herhangi bir ultrayapısal yapıya duyarlı olmasıdır. Senkrotron cryonanoprobları şimdi yüksek enerjili X-ışını aralığı2613 nm gibi düşük mekansal çözünürlüklere inerek benzer zorluklar yaklaşıyor. Basılı X-ışını mikroskobu tüm hücreleri analiz ederken elektron mikroskobu elektronların yetersiz nüfuz derinliğinden muzdariptir ve sadece çok ince hücre dilimlerinin gözlemlemesini sağlar.

Hücrelerin monokatmanları sıvı etan dalma-donma tarafından, su vitrifikasyon için gerekli soğutma oranları elde böylece yeterince ince. Teorik olarak, 108 K/s’ye varan soğutma oranları, yüksek basınçlı donma27 kullanılarak mümkündür ve bu da dalma donması için çok kalın olan numunelerin vitrifikasyonuna olanak sağlar. 105 K/s’lik bir soğutma hızı, ortam basıncı28’denumunenin tam vitrifikasyonuna izin vermek için otomatik dalma-dondurma makinesi ve burada sunulan parametreler kullanılarak tekrar tekrar ulaşılır. Bu bir araştırmacı ince biyolojik örnekleri vitrifiye sağlar (<10 μm) hücrelerin bir monolayer gibi12,13,14,15,29,30 sıvı etan dalma-dondurma tarafından.

Bu protokol ile önemli bir sorun da 2D veya 3D hücre içinde güvenilir element dağılımları sağlamak için hücre içi içeriğin kimyasal bütünlüğünü mümkün olduğunca korumaktır. Başka bir yerde yayınlandığı gibi2,16,17,31, hücre altı düzeyinde elemental görüntüleme durumunda, dondurulmuş sulu hücrelerin analizi düşünülmelidir. Aksi takdirde, dalma-dondurma ve hücrelerin dondurulması kombinasyonu oda sıcaklığı analizi için kullanılabilir. İkincisi için, amorf buz süblimleşme işlemi ile kaldırılır, bağlı su molekülleri desorpsiyon işlemi ile kaldırılır. Bu süreç, hücre zarlarının olası değişimi ve bazı hücre altı yapıların morfolojisi nedeniyle dondurulmuş sulu numunelere göre ideal olmaktan uzak olabilir32. Ayrıca, türleşme çalışmaları için, su çıkarma metal türleşme eserlere yol açabilir. Yine de, başarılı olmuştur ve alt-100 nm düzeyleri2,16,17,18,20,33,34,35,36elemental görüntüleme için dondurulmuş sulu örnekler için en iyi alternatif olmuştur.

37olarak bildirilmiştir, kriyokorunmuş hücresel preparatların kalitesi potasyum-sodyum K/Na oranı ile değerlendirilebilir. Ne yazık ki, elementlerin X-ışını floresan fotonları (E ≥ 1.3 keV magnezyum) tespit etmek için kullanılan silikon sürüklenme dedektörünün düşük enerji kesme nedeniyle, burada kullanılan sert X-ışını nanoprobuk ile henüz belirlenemez. Nitekim, Yüksek K / Na oranı (>10) TOF-SIMS, EPMA veya nükleer mikroprobun PIXE16kullanılarak ölçülebilir,37 hücrenin korunmuş kimyasal bütünlüğünün göstergesidir 25 canlı hücrede beklenen K / Na ile karşılaştırıldığında37. Bu, eşlik eden düşük Cl/K oranı38ile desteklenebilir. Yine de, kusurlu vitrifikasyon, özellikle numune soğutma hızı çok düşükse, hücre zarlarına ve organellere zarar vererek kimyasal elementlerin dağılımını değiştirebilecek büyük buz kristallerinin oluşmasına yol açabilir. Bu potansiyel hasarı ve hücre içi dağılımı nı izlemek için rutin bir prosedür olmamasına rağmen, yukarıdaki elementoranları ve x-ışını faz kontrastı veya kriyo-yumuşak X-ışını mikroskopisi kullanarak hücreyi yüksek çözünürlükte görüntüleme olasılığı, hücre içi bölmelerin element bütünlüğünün birlikte korunmasıile birlikte iyi korunmasını desteklemek için en iyi yaklaşımlar olabilir. Bu tekniklerin birleşimi ve yeni geliştirilen kriyokorsli floresan optik mikroskopların kullanımı, bu hasarın hücre içi element dağılımını ne ölçüde meydana geldiğini ve etkilediğini değerlendirmeye yardımcı olacaktır.

Genel olarak, senkrotron X-ışını floresans nano-analizi için hücresel numunehazırlamak için ayrıntılı ve kapsamlı bir protokol sunulmuştur. Bu araştırma topluluğu için iyi bir başlangıç noktası, 2D ve 3D elemental görüntüleme için uygun hücresel örnekleri hazırlamak için nasıl zor sorunu çözmek için yardımcı (kriyo) sert X-ışını nanoprobları. Bu yaklaşımlar, hücrelerin derinlemesine korelasyon kimyasal ve yapısal görüntülemesi için optik floresan ve elektron mikroskobu yetenekleri ile birleştirilebilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nano-görüntüleme ışın çizgisi ID16A üzerinde deneyler ESRF önerileri LS2430, LS2303 ve LS2765 çerçevesinde yapılmıştır.

Materials

Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O SIGMA 09691-250mL One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.
B27 supplement, 50x Life Technologies, Invitrogen 17504-044 for hippocampal neuron culture
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2) GIBCO 14190-094 cell culture
DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification) GIBCO 21885025 cell culture
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Life Technologies, Invitrogen 31966-02 for hippocampal neuron culture
Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05×0.01mm Tips, Biology World Precision Instrument 501202
Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer Quorum Technology EK3147
Ethane N45 Air Liquid p0505s05r0a001 C2H6 > 99,995 %
Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin GIBCO A31604-02 cell culture
HBSS 10x Life Technologies, Invitrogen 14185-052 for hippocampal neuron culture
Leica GP quick-release forceps Leica 16706435
MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell ATCC ATCC HTB-26 cell culture
Neurobasal medium Life Technologies, Invitrogen 21103-049 for hippocampal neuron culture
Nunc 4-Well Plate Thermo Fisher 176740 cell culture
Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer Advanced Instruments Osmo1 Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO® Vapor Pressure Osmometer)
Penicillin-Streptomycin SIGMA P4333 cell culture
poly-L-lysine SIGMA P4707 Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).
Plunge freezing robot Leica EM GP main unit Leica 16706401 Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.
Silicon nitride membrane (Si3N4) Silson Ltd. SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane…) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco…
Trypan blue solution 0.4% GIBCO 15250061 cell culture
Trypsin-EDTA, 0.05% GIBCO 25300-054 cell culture
Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water Fisher Chemicals W9-1 MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.
Whatman No. 1 filter paper with precut hole Leica 16706440 Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewis, D. J., et al. Intracellular synchrotron nanoimaging and DNA damage/genotoxicity screening of novel lanthanide-coated nanovectors. Nanomedicine. 5 (10), 1547-1557 (2010).
  2. Fus, F., et al. The intracellular localization of osmocenyl-tamoxifen derivatives in hormone-independent breast cancer cells revealed by 2D and 3D nano X-ray fluorescence imaging. Angwendte Chemie. , (2019).
  3. Janssens, K., Adams, F., Rindby, A. . Microscopic X-Ray Fluorescence Analysis. , (2000).
  4. Carmona, A., et al. Uranium exposure of human dopaminergic cells results in low cytotoxicity, accumulation within sub-cytoplasmic regions, and down regulation of MAO-B. Neurotoxicology. 68, 177-188 (2018).
  5. Leapman, R. D., Hunt, J. A., Buchanan, R. A., Andrews, S. B. Measurement of low calcium concentrations in cryosectioned cells by parallel-EELS mapping. Ultramicroscopy. 49 (1-4), 225-234 (1993).
  6. Saubermann, A. J., Echlin, P., Peters, P. D., Beeuwkes, R. Application of scanning electron microscopy to X-ray analysis of frozen hydrated sections. I. Specimen handling techniques. Journal of Cell Biology. 88 (2), 257-267 (1981).
  7. Saubermann, A. J., Heyman, R. V. Quantitative digital X-ray imaging using frozen hydrated and frozen dried tissue sections. Journal of Microscopy. 146, 169-182 (1987).
  8. Wroblewski, J., Roomans, G. M. X-ray microanalysis of single and cultured cells. Scanning Electron Microscopy. , 1875-1882 (1984).
  9. Wroblewski, J., Müller, R. M., Wroblewski, R., Roomans, G. M. Quantitative X-ray microanalysis of semi-thick cryosections. Histochemistry. 77 (4), 447-463 (1983).
  10. Zierold, K. Cryopreparation of mammalian tissue for X-ray microanalysis in STEM. Journal of Microscopy. 125, 149-156 (1982).
  11. Harkiolaki, M., et al. Cryo-soft X-ray tomography: Using soft X-rays to explore the ultrastructure of whole cells. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 81-92 (2018).
  12. McDermott, G., Le Gros, M. A., Knoechel, C. G., Uchida, M., Larabell, C. A. Soft X-ray tomography and cryogenic light microscopy: the cool combination in cellular imaging. Trends in Cell Biology. 19 (11), 587-595 (2009).
  13. Schneider, G., et al. Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy. Nature Methods. 7 (12), 985-987 (2010).
  14. Sorrentino, A., et al. MISTRAL: a transmission soft X-ray microscopy beamline for cryo nano-tomography of biological samples and magnetic domains imaging. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (4), 1112-1117 (2015).
  15. Carzaniga, R., Domart, M. C., Duke, E., Collinson, L. M. Correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray tomography of adherent cells at European synchrotrons. Methods in Cell Biology. 124, 151-175 (2014).
  16. Perrin, L., Carmona, A., Roudeau, S., Ortega, R. Evaluation of sample preparation methods for single cell quantitative elemental imaging using proton or synchrotron radiation focused beams. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30 (12), 2525-2532 (2015).
  17. Jin, Q., et al. Preserving elemental content in adherent mammalian cells for analysis by synchrotron-based x-ray fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 265 (1), 81-93 (2017).
  18. Daoust, A., et al. Impact of manganese on primary hippocampal neurons from rodents. Hippocampus. 24 (5), 598-610 (2014).
  19. Daoust, A., et al. Manganese Cytotoxicity Assay on Hippocampal Neuronal Cell Culture. Bio-protocol. 5 (1), 1368 (2015).
  20. Gibon, J., et al. The over-expression of TRPC6 channels in HEK-293 cells favours the intracellular accumulation of zinc. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1808 (12), 2807-2818 (2011).
  21. Hasna, J., Bohic, S., Lemoine, S., Blugeon, C., Bouron, A. Zinc Uptake and Storage During the Formation of the Cerebral Cortex in Mice. Molecular Neurobiology. , 1-13 (2019).
  22. Villar, F., et al. Nanopositioning for the ESRF ID16A Nano-Imaging Beamline. Synchrotron Radiation News. 31 (5), 9-14 (2018).
  23. Kosior, E., et al. Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for subcellular metal quantification. Journal of Structural Biology. 177 (2), 239-247 (2012).
  24. Bohic, S., et al. Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells. Applied Physics Letters. 78, 3544-3546 (2001).
  25. Dubochet, J. On the Development of Electron Cryo-Microscopy (Nobel Lecture). Angwendte Chemie. 57 (34), 10842-10846 (2018).
  26. Da Silva, J. C., et al. Efficient concentration of high-energy X-rays for diffraction-limited imaging resolution. Optica. 4 (5), 492-495 (2017).
  27. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high-pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
  28. Moor, H., Steinbrecht, R. A., Zierold, K. Theory and pratice of high pressure freezing. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , 175-191 (1987).
  29. Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Journal of Electron Microscopy Techniques. 3 (2), 177-210 (1986).
  30. Ferreira, J. L., Matthews-Palmer, T. R., Beeby, M. Electron Cryo-Tomography. Cellular Imaging. , 61-94 (2018).
  31. Colvin, R. A., Jin, Q., Lai, B., Kiedrowski, L. Visualizing metal content and intracellular distribution in primary hippocampal neurons with synchrotron X-ray fluorescence. PLoS One. 11 (7), 0159582 (2016).
  32. Vavpetič, P., et al. Elemental distribution and sample integrity comparison of freeze-dried and frozen-hydrated biological tissue samples with nuclear microprobe. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 348, 147-151 (2015).
  33. Guerquin-Kern, J. L., Bordat, C. Cryo-preparation procedures for elemental imaging by sims and eftem. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. , 499-536 (2008).
  34. Gramaccioni, C., et al. Nanoscale quantification of intracellular element concentration by X-ray fluorescence microscopy combined with X-ray phase contrast nanotomography. Applied Physics Letters. 112 (5), 053701 (2018).
  35. Perrin, L., et al. Zinc and Copper Effects on Stability of Tubulin and Actin Networks in Dendrites and Spines of Hippocampal Neurons. ACS Chemical Neurosciences. 8 (7), 1490-1499 (2017).
  36. Ortega, R., et al. α-synuclein over-expression induces increased iron accumulation and redistribution in iron-exposed neurons. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1925-1934 (2016).
  37. Fartmann, M., et al. Quantitative imaging of atomic and molecular species in cancer cultures with TOF-SIMS and Laser-SNMS. Applied Surface Sciences. 231 (2), 428-431 (2004).
  38. Pålsgård, E., Lindh, U., Roomans, G. M. Comparative study of freeze-substitution techniques for X-ray microanalysis of biological tissue. Microscopy Research and Techniques. 28 (3), 254-258 (1994).

Tags

Cell CultureSilicon Nitride MembraneCryopreparationSynchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysisCryofixationFrozen Hydrated CellsElemental DistributionRadiation DamageCell MonolayerPoly-L-lysineAttachment FactorUltra Pure WaterCell SeedingCell Culture Medium

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bissardon, C., Reymond, S., Salomé, M., André, L., Bayat, S., Cloetens, P., Bohic, S. Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis. J. Vis. Exp. (154), e60461, doi:10.3791/60461 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image