Presentato qui è un protocollo per la coltura cellulare sulle membrane di nitrato di silicio e il congelamento del tuffo prima dell’imaging a fluorescenza a raggi X con una nanosonda a raggi X criogenica sincrotrone. Quando viene fornita solo una nano-analisi a temperatura ambiente, i campioni congelati possono essere ulteriormente liofilizzati. Questi sono i passaggi critici per ottenere informazioni sulla composizione elementale intracellulare.
Si sa molto poco sulla distribuzione di ioni metallici a livello subcellulare. Tuttavia, tali elementi chimici hanno funzioni normative essenziali e la loro omeostasi disturbata è coinvolta in varie malattie. Le nanosonda a fluorescenza a raggi X del sincrotrone all’avanguardia forniscono la sensibilità e la risoluzione spaziale necessarie per chiarire la distribuzione e la concentrazione bidimensionale (2D) e tridimensionali (3D) di metalli all’interno di intere cellule livello di organello. Questo apre nuovi interessanti campi scientifici di indagine sul ruolo dei metalli nella fisiopatologia della cellula. La preparazione cellulare è una procedura chiave e spesso complessa, in particolare per l’analisi di base. Sebbene le tecniche di fluorescenza a raggi X siano ormai diffuse e siano stati utilizzati vari metodi di preparazione, pochissimi studi hanno studiato la conservazione del contenuto elementare delle cellule nella migliore delle due opzioni e nessun protocollo dettagliato graduale per la criopreparazione finora sono state rilasciate cellule aderenti alle nanosonda a fluorescenza a raggi X. Questa è una descrizione di un protocollo che fornisce la preparazione cellulare graduale per la criofissia rapida per consentire la nanoanalisi della fluorescenza a raggi X del sincrotrone delle cellule in uno stato idratato congelato quando è disponibile un ambiente criogenico e un trasferimento. Nel caso in cui la nanoanalisi debba essere eseguita a temperatura ambiente, viene fornita una procedura aggiuntiva per l’essiccazione congelata della preparazione cellulare dell’aderente criofissa. I protocolli proposti sono stati utilizzati con successo in lavori precedenti, più recentemente nello studio della distribuzione intracellulare 2D e 3D di un composto organometallico nelle cellule del cancro al seno.
Le nanosonda a raggi X a raggi X (SR-XRF) di nuova progettazione consentono la visualizzazione della distribuzione subcellulare degli elementi in modo completamente quantitativo. Ad esempio, questa capacità analitica consente di esaminare l’assorbimento di nanoparticelle1 o molecole organometallici come i complessi a base di osmio2,fornendo informazioni sull’assorbimento intracellulare di molecole a base metallica con potenti proprietà anticancro. Come tecnica multielemento, SR-XRF3 con una nanosonda fornisce un modo per quantificare e localizzare simultaneamente elementi intracellulari più biologicamente importanti, tra cui fosforo, zolfo, potassio, calcio, ferro, rame e zinco. Infatti, l’uso di raggi X duri fornisce una grande profondità di penetrazione per l’immagine di intere cellule idratate congelate in modo privo di etichette. Inoltre, fornendo l’accesso al bordo K della maggior parte degli elementi di interesse, la fluorescenza a raggi X è eccitata in modo più efficiente. L’uso di approcci criogenici consente la riduzione dei danni da radiazioni e l’ottimizzazione della conservazione della struttura cellulare e della distribuzione elementale.
La maggior parte delle tecniche analitiche a risoluzione spaziale disponibili per studiare i metalli nelle cellule sono tecniche di superficie che richiedono sezioni di cellule molto sottili e piatte da produrre. Ciò comprende principalmente la microscopia elettronica a trasmissione a scansione con analisi a raggi X dispersiva di energia (STEM-EDX), la microscopia elettronica a trasmissione filtrata dall’energia (EF-TEM) e la spettrometria di massa iografica secondaria su nanoscala (nanoSIMS). Quest’ultimo non può essere eseguito su sezioni cellulari congelate e idratate, mentre la crio-analisi può essere fatta con microscopia elettronica con risoluzione spaziale insuperabile ma scarsa sensibilità elementare. L’emissione di raggi X indotta dalle particelle (PIXE) ha permesso lo studio delle distribuzioni elementali in celle intere. Ha il vantaggio di essere completamente quantitativo con una giusta sensibilità elementale su scala micron e anche con risoluzione submicron4, ma soffre di danni da radiazioni e mancanza di capacità criogeniche per studiare le cellule idratate congelate. Tutte queste tecniche analitiche si completano a vicenda nell’imaging elementare delle cellule, ma per tutte le tecniche la procedura di preparazione del campione è un passo cruciale. Per ottenere risultati significativi, è consigliabile limitare la possibile contaminazione e la ridistribuzione elementare e/o le perdite. Come dimostrato nella microscopia elettronica, un flusso di lavoro criogenico, compreso crio-immobilizzazione della cellula e criotrasferimento a una fase di crioscansione, consente una conservazione elementare ottimale a livelli subcellulari il più vicino possibile allo stato nativo5,6,7,8,9,10. Questa comprensione è stata implementata con successo nello sviluppo della microscopia a raggi X crio-morbida del synchrotron (ad esempio, microscopi a campo completo e microscopi a scansione) per produrre immagini ultrastrutturali di intere cellule idratate congelate in 2D o 3D. Vari flussi di lavoro criogenici sono stati sviluppati11 per microscopi a raggi X morbidi a Beamline 2.1 (XM-2) dell’Advanced Light Source presso il Lawrence Berkeley National Laboratory12, beamline U41-XM presso l’anello di stoccaggio degli elettroni BESSY II (Germania)13, fascio MISTRAL della sorgente luminosa ALBA (Spagna)14, e a Beamline B24 della fonte di luce15. Un flusso di lavoro simile è stato recentemente dimostrato di essere il metodo di preparazione e conservazione più affidabile per l’analisi elementale intracellulare utilizzando microsonde a raggi X16,17.
Anche se le tecniche di nanosonda a raggi X stanno iniziando ad essere ampiamente utilizzate per l’analisi degli elementali cellulari, in particolare con l’avvento delle capacità criogeniche SR-XRF, nessun protocollo graduale è stato diffuso finora alla comunità di ricerca. Qui viene fornita una procedura dettagliata per preparare cellule aderenti criofisse coltivate come monostrati su membrane di nitrato di silicio da analizzare in condizioni criogeniche. Viene fornita anche una fase di congelamento dell’essiccazione dopo il protocollo nel caso in cui l’analisi a raggi X debba essere eseguita a temperatura ambiente. Mentre il protocollo proposto è stato utilizzato con successo con le cellule di cancro al seno umano MD-MB-2312 e l’essiccazione congelato è stata dimostrata tra gli altri su neuroni del topo18,20,21, può essere facilmente esteso a vari tipi di cellule umane o animali.
La microscopia crioelettronica (crio-EM) ha vinto il Premio Nobel per la chimica 2017 e come tale lo sviluppo di J. Dubochet sulla vetrificazione del materiale biologico per la determinazione della struttura ad alta risoluzione delle biomolecole nella soluzione25. Come riportato da Dubochet nella sua lezione di Nobel “Sapere come vinificare una goccia d’acqua è una cosa, preparare un campione biologico per l’osservazione biologica è un altro”25. I passaggi di criopreparazione sono ora considerati la tecnica standard per mitigare i danni alla dose di radiazioni e studiare le cellule vicine al loro stato nativo. La preparazione rimane però noiosa. Questo perché la microscopia elettronica, a causa della sua risoluzione spaziale insuperabile, è sensibile a qualsiasi artefatto ultrastrutturale che si verifica durante la preparazione del campione. Le crionde di sincrotrone si stanno ora avvicinando a difficoltà simili che si stanno abgiusto per raggiungere risoluzioni spaziali a partire da 13 nm nell’intervallo a raggi X ad alta energia26. La microscopia a raggi X duro è in grado di analizzare intere cellule, mentre la microscopia elettronica soffre della scarsa profondità di penetrazione degli elettroni, consentendo di osservare solo fette cellulari molto sottili.
I monostrati delle cellule sono abbastanza sottili da raggiungere il congelamento dei mmeriti nell’etano liquido. In teoria, sono possibili velocità di raffreddamento fino a 108 K/s utilizzando il congelamento ad alta pressione27 che consente la vetrificazione di campioni troppo spessi per il congelamento dei mmeriti. Una velocità di raffreddamento di 105 K/s, necessaria per consentire la vetrificazione completa del campione a pressione ambientale28, viene raggiunta riproducibilmente utilizzando la macchina di congelamento automatica del tuffo e i parametri qui presentati. Ciò consente a un ricercatore di vinificare campioni biologici sottili (<10 m) come un monostrato di cellule12,13,14,15,29,30 mediante il congelamento dei guasti liquidi in etano liquido.
Una sfida importante con questo protocollo è anche quello di preservare il più possibile l’integrità chimica del contenuto intracellulare per fornire distribuzioni elementali affidabili all’interno della cellula in 2D o 3D. Come pubblicato altrove2,16,17,31, nel caso dell’imaging elementare a livello subcellulare, l’analisi delle cellule idratate congelate dovrebbe essere considerata. In caso contrario, la combinazione di congelamento del guasto e congelamento delle cellule può essere utilizzata per l’analisi della temperatura ambiente. Per quest’ultimo, il ghiaccio amorfo viene rimosso attraverso il processo di sublimazione, mentre le molecole d’acqua rilegate vengono rimosse attraverso il processo di desorpazione. Questo processo può essere tutt’altro che ideale rispetto ai campioni idratati congelati a causa della possibile alterazione delle membrane cellulari e della morfologia di alcune strutture subcellulari32. Inoltre, per gli studi di speciazione, l’estrazione dell’acqua può portare a manufatti di speciazione metallici. Tuttavia, ha avuto successo e la migliore alternativa ai campioni idratati congelati per l’imaging elementare a sotto-100 nm livelli2,16 ,17,18,20,33,34,35,36.
Come è stato riportato37, la qualità dei preparati cellulari crioconservati può essere valutata attraverso il rapporto potassio-sodio K/Na. Purtroppo, non è ancora possibile determinare con la nanosonda a raggi X dura utilizzata qui, a causa del taglio a bassa energia del rilevatore di deriva di silicio utilizzato per rilevare i fotoni a fluorescenza a raggi X degli elementi (E – 1,3 keV magnesio). Infatti, un alto rapporto K/Na (>10) che può essere misurato utilizzando TOF-SIMS, EPMA, o microprobe nucleare PIXE16,37 è indicativo dell’integrità chimica conservata della cellula rispetto al K/Na previsto di 25 in una cellula vivente37. Questo può essere supportato da un concomitante basso rapporto Cl/K38. Tuttavia, la vetrificazione imperfetta, in particolare se la velocità di raffreddamento del campione è troppo bassa, può portare alla formazione di grandi cristalli di ghiaccio che possono danneggiare le membrane cellulari e gli organelli, alterando di conseguenza la distribuzione di elementi chimici. Anche se non esiste una procedura di routine per monitorare questo potenziale danno e impatto sulla distribuzione intracellulare, i rapporti elementali di cui sopra e la possibilità di immagine della cellula ad alta risoluzione utilizzando il contrasto di fase a raggi X o la microscopia a raggi X crio-morbida possono essere i migliori approcci per supportare una buona conservazione dei compartimenti intracellulari con la conservazione concomitante dell’integrità elementare. La combinazione di queste tecniche e l’uso di microscopi ottici a fluorescenza criofrontelita di recente sviluppo aiuteranno a valutare in che misura si verifica questo danno e colpisce la distribuzione elementale intracellulare.
Nel complesso, viene presentato un protocollo dettagliato e completo per preparare campioni cellulari per la nanoanalisi della fluorescenza a raggi X del sincrotrone. È un buon punto di partenza per la comunità di ricerca, aiutando a risolvere il difficile problema di come preparare campioni cellulari appropriati per l’imaging elementare 2D e 3D a (crio) nanoprobe a raggi X duri. Questi approcci possono essere uniti a fluorescenza ottica e capacità di microscopia elettronica per l’imaging chimico e strutturale correlatoale approfondito delle cellule.
The authors have nothing to disclose.
Gli esperimenti sulla nano-imaging trave ID16A sono stati eseguiti nel quadro delle proposte ESRF LS2430, LS2303 e LS2765.
Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O | SIGMA | 09691-250mL | One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway. |
B27 supplement, 50x | Life Technologies, Invitrogen | 17504-044 | for hippocampal neuron culture |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2) | GIBCO | 14190-094 | cell culture |
DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification) | GIBCO | 21885025 | cell culture |
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Life Technologies, Invitrogen | 31966-02 | for hippocampal neuron culture |
Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05×0.01mm Tips, Biology | World Precision Instrument | 501202 | |
Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer | Quorum Technology | EK3147 | |
Ethane N45 | Air Liquid | p0505s05r0a001 | C2H6 > 99,995 % |
Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin | GIBCO | A31604-02 | cell culture |
HBSS 10x | Life Technologies, Invitrogen | 14185-052 | for hippocampal neuron culture |
Leica GP quick-release forceps | Leica | 16706435 | |
MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell | ATCC | ATCC HTB-26 | cell culture |
Neurobasal medium | Life Technologies, Invitrogen | 21103-049 | for hippocampal neuron culture |
Nunc 4-Well Plate | Thermo Fisher | 176740 | cell culture |
Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer | Advanced Instruments | Osmo1 | Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO® Vapor Pressure Osmometer) |
Penicillin-Streptomycin | SIGMA | P4333 | cell culture |
poly-L-lysine | SIGMA | P4707 | Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged). |
Plunge freezing robot Leica EM GP main unit | Leica | 16706401 | Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing. |
Silicon nitride membrane (Si3N4) | Silson Ltd. | SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl | The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane…) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco… |
Trypan blue solution 0.4% | GIBCO | 15250061 | cell culture |
Trypsin-EDTA, 0.05% | GIBCO | 25300-054 | cell culture |
Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water | Fisher Chemicals | W9-1 | MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis. |
Whatman No. 1 filter paper with precut hole | Leica | 16706440 | Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used. |