Clonal Genetic Tracing utilizzando il mouse Corfetti per studiare i tessuti mineralizzati
Summary
Questo metodo descrive l’uso del modello murino R26R-Confetti (Coriandoli) per studiare i tessuti mineralizzati, coprendo tutte le fasi dalla strategia di allevamento all’acquisizione di immagini. Incluso è un protocollo generale che può essere applicato a tutti i tessuti molli e un protocollo modificato che può essere applicato ai tessuti mineralizzati.
Abstract
Etichettare una singola cellula nel corpo per monitorare quali tipi di cellule può dare origine e monitorare la sua migrazione attraverso l’organismo o determinare la sua longevità può essere un modo potente per rivelare i meccanismi di sviluppo e manutenzione dei tessuti. Uno degli strumenti più importanti attualmente disponibili per monitorare le celle in vivo è il modello di mouse Corfetti. Il modello Coriandoli può essere utilizzato per etichettare geneticamente singole cellule in topi viventi con varie proteine fluorescenti in modo specifico del tipo di cellula e monitorare il loro destino, così come il destino della loro progenie nel tempo, in un processo chiamato tracciazione genetica clonale o tracciamento del lignaggio clonale. Questo modello è stato generato quasi dieci anni fa e ha contribuito a una migliore comprensione di molti processi biologici, in particolare legati alla biologia delle cellule staminali, allo sviluppo e al rinnovamento dei tessuti adulti. Tuttavia, preservare il segnale fluorescente fino alla raccolta delle immagini e alla cattura simultanea di vari segnali fluorescenti è tecnicamente impegnativo, in particolare per i tessuti mineralizzati. Questa pubblicazione descrive un protocollo passo-passo per l’utilizzo del modello Coriandoli per analizzare la cartilagine della piastra di crescita che può essere applicata a qualsiasi tessuto mineralizzato o non mineralizzato.
Introduction
Metodi migliorati per monitorare il comportamento delle cellule sono desiderabili per aumentare l’efficienza sperimentale quando si utilizzano modelli animali. Uno degli approcci più informativi per monitorare il comportamento delle cellule in vivo è il tracciamento del lignaggio clonale con ceppi di mouse reporter multicolore1, incluso il mouse R26R-Confetti (Confetti)2ampiamente utilizzato. Etichettando geneticamente singole cellule con proteine fluorescenti e seguendo quelle cellule nel tempo, i ricercatori di molti campi hanno usato il topo coriandoli per rivelare informazioni su una moltitudine di diversi sistemi biologici.
Il mouse confetti è un sistema di reporter basato su loxP in cui la ricombinazione del DNA dipendente di Cre provoca l’espressione permanente di una delle diverse possibili proteine fluorescenti in modo stocastico2. L’allelio R26R-Confetti comprende l’onnipresente promotore CAGG, che si trova immediatamente a monte di un NeoR-cassette2fiancheggiato da loxP, la cui sequenza di poliadenzione termina la trascrizione3, seguita dalla Brainbow 2.1 costrutto4. Quindi, la ricombinazione mediata da Cre eccita contemporaneamente la NeoR-cassettee porta alla produzione di alcune proteine fluorescenti a seconda di quali parti del costrutto Brainbow 2.1 vengono assoggettate. Questa caratteristica rende il mouse Coriamia estremamente adattabile perché può essere utilizzato per indirizzare qualsiasi popolazione cellulare in un mouse per il quale è disponibile una specifica deformazione Cre. L’attraversamento di un ceppo Cre specifico per tessuto con la varietà R26R-Confetti fornisce la specificità dell’etichettatura. Tuttavia, il ceppo Cre dovrebbe anche essere inducibile (ad esempio, CreERT o CreERT2, che richiedono l’associazione di tamoxifene per consentire loro di entrare nel nucleo e indurre la ricombinazione del DNA5)in modo che l’etichettatura possa essere ottenuta in punti temporali specificati. Così, una popolazione cellulare può essere etichettata iniettando la prole positiva e coriandola risultante con tamoxifene nel punto di tempo desiderato e monitorata a una certa età, quando i tessuti di interesse possono essere raccolti per l’analisi. Dopo l’elaborazione dei tessuti, le cellule etichettate fluorescentmente possono essere visualizzate direttamente mediante microscopia confocale in modo che la progenie di ciascuna cellula etichettata inizialmente possa essere separata dalla progenie generata da qualsiasi altra cellula etichettata in base alla loro fluorescente specifica etichette, consentendo in tal modo la clonalità da valutare (cioè il tracciamento genetico clonale).
Grazie alla flessibilità del modello Coriandoli, è stato applicato per studiare lo sviluppo e il mantenimento di molti tessuti diversi in salute e malattia2,6,7,8,9, 10,11. Un modo comune per utilizzare il modello è quello di etichettare una certa popolazione di cellule e determinare a quali tessuti hanno contribuito (e/o la loro progenie). Una di queste scoperte utilizzando questo approccio è stato che il dente adulto è costituito da cellule con un’origine glial6. Un’altra applicazione del modello è quella di studiare l’omeostasi delle cellule staminali. Ad esempio, il modello Coriandoli ha rivelato che le nicchie di cellule staminali nelle cripte intestinali diventano gradualmente monoclonali perché alcuni cloni di cellule staminali sono dominanti durante la competizione tra le cellule staminali2. Il modello può essere utilizzato anche per valutare la proliferazione cellulare, che è particolarmente utile per studiare lentamente le cellule che si dividono. Ad esempio, è stata valutata la formazione di clonale nella cartilagine articolare12 ed è statostudiatogli effetti a breve termine di un antagonista del riccio sulla placca di crescita condrociti in topi di cinque settimane.
Nonostante la relativa semplicità del modello Coriandoli, il segnale fluorescente può essere tecnicamente impegnativo da preservare fino alla raccolta delle immagini, in particolare quando si analizzano i tessuti mineralizzati. Qui, il protocollo descrive un modello ottimizzato per utilizzare il mouse Coriamia con l’osso postnatale (fino a 6 mesi di età), consentendo alle proteine fluorescenti di essere visualizzate direttamente mediante microscopia confocale senza la necessità di immunodiagnosi. Questo protocollo semplificato può essere applicato ai tessuti non mineralizzati. Inoltre, è inclusa una descrizione di come conservare i campioni al fine di preservare il segnale fluorescente per un periodo prolungato di almeno 3 anni. Nella figura 1viene presentato un contorno del protocollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il modello Confetti è stato ampiamente utilizzato per studiare i tessuti della cartilagine mineralizzati12,13,14 e per descrivere il protocollo ottimizzato. I topi di coriandoli2 con una o due copie dell’allelica R26R-Confetti possono essere utilizzati per l’allevamento e gli esperimenti. La ricombinazione dei topi con un allele del costrutto brainbow 2.1 fornirà quattro etichette potenziali: proteina fluorescente rossa (RFP, citoplasma), proteina fluorescente gialla (YFP, citoplasma, proteina fluorescente cianale (CFP, membrana-localizzata) e verde proteine fluorescenti (GFP, nucleo-localizzato), mentre la ricombinazione nei topi omozigagi coriandoli (cioè, contenenti due copie del costrutto Brainbow 2.1) fornirà 10 possibili output di colore (RFP-RFP, RFP-YFP, RFP CFP, CFP, CFP, GFP, GFP- GFP). Tuttavia, poiché gli eventi di escissione e inversione del DNA si verificano in modo stocastico, la ricombinazione per produrre GFP si verifica solo in una piccola frazione di cellule, come riportato in precedenza2, e apparentemente differisce per tipo di cellula o linea Cre utilizzata2, 12,13. Quindi, data la bassa occorrenza di eventi di ricombinazione che portano all’espressione GFP, sei uscite di colore sono le più comuni nei topi coriandoli omozici.
Una considerazione importante quando si pianificano esperimenti con il mouse Coriamie è quello di trovare un ceppo Cre adatto. In primo luogo, dal momento che l’allele Corfetti ha diversi siti loxP, un evento di ricombinazione non preclude un secondo4. Ciò significa che se una cella viene etichettata e si divide per produrre un clone di un colore, un secondo evento di ricombinazione in una delle sue cellule figlie genererebbe un colore diverso, mascherando così la vera espansione clonale. Pertanto, i ceppi Cre non inducibili, dove l’enzima è sempre attivo se il promotore corrispondente è attivo, non sono consigliabili. In secondo luogo, in alcuni ceppi l’espressione di Cre ricombinase spesso va a scapito di una proteina endogena, creando così un fenotipo proprio (ad esempio, per la varietà del topo Knock-in Prg4-GFPCreERT2 in cui i topi ospitano due alleli Cre(15), quindi una singola copia dell’allele Del Cre è auspicabile. In tutti gli esperimenti descritti, una singola copia del Col2CreERT16 è stata trasportata dal maschio o dal genitore femmina per generare topi Col2CreERT:Confetti, come descritto13. Successivamente, la specificità della linea Cre per il tipo di cella di interesse è una considerazione importante. Ad esempio, Col2CreERT è specifico di condrociti, ma etichetta diverse popolazioni distinte di condrociti nella cartilagine postnatale17. Infine, l’attività di diversi ceppi Di Cre può cambiare considerevolmente con l’età animale, in quanto l’attività endogena del promotore utilizzata per i cambiamenti di espressione Del Cre, anche nelle cellule dello stesso tipo (ad esempio, Prg4-GFPCreERT2, che può richiedere un aumento numero di dosi di tamoxifene per etichettare le cellule superficiali della zona come topi dietà compresatra 15 anni ).
Il numero di cellule etichettate sarà riflesso dalla quantità di tamoxifene data, quindi non è sempre auspicabile dare la dose massima perché distinguere i cloni l’uno dall’altro può essere difficile. Perché l’espressione Cre varierà sotto la regolazione di diversi promotori così come con l’età, il dosaggio di tamoxifene dovrà essere regolato per ottimizzare l’etichettatura. È importante notare che le cellule non sono immediatamente fluorescenti al momento dell’attivazione della ricombinazione perché è necessario tempo perché la ricombinazione si verifichi e le proteine fluorescenti risultanti si accumulino sufficientemente per l’imaging. È necessaria un’ampia gamma di ore (tra i 24 e i 72 h), che sembra essere influenzata dalla linea Cre, dal tipo di cellula e dall’età animale. Poiché il tamoxifene può essere biologicamente attivo molto tempo dopo la somministrazione18 è sempre consigliabile controllare a fondo l’efficienza di ricombinazione in ogni modello.
Durante la fase di microscopia confocale, l’eccitazione delle proteine fluorescenti Coriandoli richiede la penetrazione del tessuto da parte della luce laser. Poiché tessuti diversi hanno proprietà diverse, la luce laser potrebbe non penetrare sezioni spesse 160 m di tutti i tessuti. Tuttavia, tali sezioni spesse possono essere utilizzate per la cartilagine della piastra di crescita, come utilizzato in Figura 2, Figura 3. Si noti che ogni microscopio è diverso ed è improbabile che le impostazioni descritte (File supplementare 1) funzionino perfettamente senza piccole regolazioni. Una delle principali sfide è distinguere le diverse proteine fluorescenti per garantire che non vi sia contaminazione da un canale all’altro. Ad esempio, il segnale nel canale YFP causato dalla fluorescenza proveniente da GFP si sovrappone tra i canali YFP e RFP. Anche i canali YFP e CFP devono essere attentamente controllati. Questo può essere fatto in diversi modi. In primo luogo, la gamma di emissione di lunghezze d’onda luminose fluorescenti registrate per ogni proteina fluorescente può essere ridotta. In secondo luogo, regolare la potenza del laser in combinazione con il guadagno digitale può ottimizzare il segnale. In questo studio questi passaggi erano sufficienti, ma si basano su un forte segnale fluorescente. Ciò significa che in teoria, l’elaborazione dei tessuti inefficiente può ridurre l’attività delle proteine fluorescenti, o una debole fonte di luce laser può compromettere la separazione dei canali.
Uno dei vantaggi del topo Corfetti è che può essere combinato con un gran numero di ceppi geneticamente mutanti che sono disponibili in modo che l’impatto di geni specifici sulla dinamica clonale possa essere studiato10,11,12 ,13,14,19,20, anche se con alcune limitazioni. Ad esempio, la ricombinazione degli alleli Coriandoli e del gene di interesse non può essere separata quando si utilizzano mutanti a base di Cre loxP combinati con la tracciatura del lignaggio clonale. Tuttavia, tali eventi di ricombinazione coincidente possono essere efficaci10,14,20. Per esempio, questa possibilità è stata utilizzata per esplorare l’aumento del numero di cellule nella zona di riposo dei topi in seguito all’ablazione postnatale specifica di TSC1 nella piastra di crescita21 e ha rivelato la relazione clonale tra queste cellule nel tempo 13.Inoltre, l’analisi clonale specifica del tessuto utilizzando i topi Corfetti può essere utilizzata con topi mutanti non-Cre loxP11, ed è anche possibile combinare questi approcci con imicrofonifarmacologici8,9 ,13 e/o modelli chirurgici8 per visualizzare le risposte clonali ad altre perturbazioni funzionali. Ulteriori opportunità sorgono quando si combinano sezioni etichettate Confetti con il rilevamento immuno-rilevamento di proteine endogene per immunofluorescenza. Tale analisi consente l’identificazione delle cellule tracciate e la loro co-localizzazione con un marcatore noto. Con il metodo di fissazione descritto qui, è possibile condurre l’immunofluorescenza e visualizzare ancora la fluorescenza dalle proteine fluorescenti dei coriandoli12,13. Tuttavia, nei documenti menzionati, il recupero dell’antigene non era necessario. I metodi di recupero dell’antigene duro, come l’ebollizione nel tampone di citrati, porta ad una completa perdita di fluorescenza dei coriandoli. Anche se le proteine fluorescenti Coriandoli possono quindi essere rilevate utilizzando anticorpi22, può verificarsi una perdita di identità clonale.
In sintesi, l’utilizzo del modello Coriandoli per etichettare le celle in vivo è uno strumento informativo per analizzare il destino di tali cellule nel tempo. Il metodo descritto fornisce un modo rapido ed efficiente per visualizzare direttamente l’espressione delle proteine fluorescenti nei tessuti mineralizzati.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Evgeny Ivashkin per la consulenza metodologica. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Consiglio svedese delle ricerche (A.S.C),Fondazione Scientifica Russa (grant #19-15-00241 all’ASC), dall’Istituto Karolinska (A.S.C.), da StratRegen KI e da Stiftelsen Konung Gustaf V:s 80-srf (A.S.C.), Stiftelsen( ) Stiftelsen Frimurare Barnhuset e Sallskapet Barnavard (P.T.N.), Chinese Scholarship Council (B. Il microscopio confocale è stato finanziato dalla Fondazione Knut e Alice Wallenberg.
Materials
| 2,2-thiodiethanol | Sigma | MKCF9328 | |
| 60 mm-long cover slips | Mendel-Gläzer | 220588 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | |
| Cryomold (standard) | Sakura | 4557 | |
| Cryostat | Thermo | Model: NX70 | |
| Disposable cryostat blades | Histolab | 207500014 | Specifically for use with hard tissue |
| EDTA | Scharlan | AC0960005P | |
| Formaldehyde concentrate | Merck | 8.18708.1000 | |
| Glass bottles | Sigma | V7130 | Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing |
| Imaris software | Oxford Instruments | N/A | Image analysis software for 3D reconstruction |
| Isoflurane | Zoetis | 11-8162 | |
| OCT | Sakura | 102094-104 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| PBS | Gibco | 14200075 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1.06498.1000 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost UltraPlus slides | Mendel-Gläzer | J3800AMNZ | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Zen2 software | Zeiss | N/A | Freeware for Confocal laser scanning microscopy |
References
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