التتبع الوراثي الكلونال باستخدام الماوس الحلويات لدراسة الانسجه المعدنية
Summary
تصف هذه الطريقة استخدام نموذج الماوس R26R (الحلويات) لدراسة الانسجه المعدنية ، والتي تغطي جميع الخطوات من استراتيجية التكاثر إلى acquirements الصورة. وشملت هو بروتوكول العامة التي يمكن تطبيقها علي جميع الانسجه الرخوة وبروتوكول تعديل التي يمكن تطبيقها علي الانسجه المعدنية.
Abstract
وصف خليه فرديه في الجسم لرصد أنواع الخلايا التي يمكن ان تؤدي إلى وتتبع هجرتها من خلال الكائن الحي أو تحديد طول العمر يمكن ان يكون وسيله قويه للكشف عن أليات لتطوير الانسجه والصيانة. واحده من أهم الاداات المتاحة حاليا لمراقبه الخلايا في الجسم المجري هو نموذج الماوس كونفيتي. ويمكن استخدام نموذج حلويات لتسميه الخلايا الفردية وراثيا في الفئران الحية مع البروتينات الفلورية المختلفة في نوع الخلية بطريقه محدده ورصد مصيرهم ، فضلا عن مصير ذريتهم مع مرور الوقت ، في عمليه تسمي التتبع الوراثية النسيلي أو تتبع سلاله الكلونال. وقد ولد هذا النموذج قبل عقد من الزمن تقريبا ، واسهم في تحسين فهم العديد من العمليات البيولوجية ، ولا سيما المتعلقة ببيولوجيا الخلايا الجذعية ، والتنمية ، وتجديد انسجه الكبار. ومع ذلك ، فان الحفاظ علي اشاره الفلورسنت حتى جمع الصور والتقاط المتزامن للإشارات الفلورية المختلفة يشكل تحديا من الناحية التقنية ، خاصه بالنسبة للانسجه المعدنية. يصف هذا المنشور بروتوكول خطوه بخطوه لاستخدام نموذج الحلويات لتحليل غضروف صفيحه النمو التي يمكن تطبيقها علي اي نسيج معدني أو غير معدني.
Introduction
الأساليب المحسنة لمراقبه سلوك الخلايا مرغوب فيها لزيادة الكفاءة التجريبية عند استخدام النماذج الحيوانية. واحده من أكثر الطرق المفيدة لمراقبه سلوك الخلية في الجسم الفيفو هو تتبع النسب الاكليليه مع سلالات الماوس مراسل متعدد ألوان1، بما في ذلك المستخدمة علي نطاق واسع R26R (القصاصات) الماوس2. من خلال وضع العلامات وراثيا الخلايا الفردية مع البروتينات الفلورية وبعد تلك الخلايا مع مرور الوقت ، وقد استخدمت الباحثين في العديد من المجالات الماوس قصاصات للكشف عن رؤى في العديد من النظم البيولوجية المختلفة.
الفار القصاصات هو نظام مراسل المستندة إلى loxP في التي Cre تعتمد الحمض النووي أعاده تركيبه يسبب التعبير الدائم لأحد العديد من البروتينات الفلورية المحتملة في الطريقة العشوائية2. وتشمل اليل R26R التي أعرب عنها بشكل مطلق المروج cagg ، والتي تقع علي الفور من المنبع loxp-الجددالذي يحيط كاسيت2، الذي تسلسل الادننه ينهي النسخ3، تليها بريقوس 2.1 بناء4. التالي ، فان أعاده الدمج بوساطة Cre تؤدي في وقت واحد إلى الوصول إلى الكاسيتالجديدويؤدي إلى إنتاج بعض البروتينات الفلورية اعتمادا علي اي أجزاء من البناء ال2.1 الذي يتم استئصاله. هذه الميزة يجعل الماوس كونفيتي قابله للتكيف للغاية لأنه يمكن استخدامها لاستهداف اي السكان الخلوية في الماوس الذي سلاله Cre محدده متاحه. عبور سلاله Cre الانسجه الخاصة مع سلاله R26R-الحلويات يوفر خصوصية الوسم. ومع ذلك ، ينبغي أيضا ان تكون سلاله Cre محرض (علي سبيل المثال ، CreERT أو CreERT2 ، والتي تتطلب ملزمه تاموكسيفين للسماح لهم بدخول النواة والحث علي أعاده دمج الحمض النووي5) بحيث يمكن تحقيق الوسم في نقاط زمنيه محدده. التالي ، يمكن تسميه السكان الخلوية عن طريق حقن الناتجة CreERT ايجابيه/قصاصات اليد الايجابيه مع تاموكسيفين في الوقت المطلوب نقطه وتعقبها إلى سن معينه ، عندما يمكن جمع انسجه الفائدة للتحليل. بعد معالجه الانسجه ، يمكن تصور الخلايا فلوريسسينتلي المسمية مباشره بواسطة المجهر البؤري بحيث يمكن فصل ذريه كل خليه المسمية في البداية من ذريه ولدت من قبل اي خليه أخرى المسمي استنادا إلى الفلورسنت الخاصة بهم التسميات ، التالي السماح كلوليتي ليتم تقييمها (اي ، التتبع الوراثية النسيلي).
نظرا لمرونة نموذج حلويات ، وقد تم تطبيقه لدراسة تطوير وصيانة العديد من الانسجه المختلفة في مجال الصحة والمرض2،6،7،8،9، 10,11. أحدي الطرق الشائعة لاستخدام النموذج هي تسميه عدد معين من الخلايا وتحديد الانسجه التي ساهمت فيها (و/أو ذريتها). وكان أحد هذه النتائج باستخدام هذا النهج هو ان الأسنان البالغ يتكون من الخلايا مع الأصل الانحدر6. تطبيق آخر للنموذج هو دراسة التوازن الخلية الجذعية. فعلي سبيل المثال ، كشف نموذج الحلويات ان الخلايا الجذعية في الشفرات المعوية تتحول تدريجيا إلى مونوكلونال لان بعض الخلايا الجذعية المستنسخة تكون مهيمنه خلال المنافسة بين الزنزانات الجذعية2. ويمكن أيضا استخدام النموذج لتقييم تكاثر الخلايا ، وهو أمر مفيد بشكل خاص لدراسة الخلايا المنقسمة ببطء. علي سبيل المثال ، تم تقييم تشكيل النسيلي في الغضروف المفصلي12 ، ودرست الآثار قصيرة الأجل من خصم القنفذ علي لوحه النمو غضروفي في الفئران القديمة خمسه أسابيع13.
وعلي الرغم من البساطة النسبية لنموذج الحلويات ، فان اشاره الفلورسنت يمكن ان تكون صعبه من الناحية الفنية للمحافظة عليها حتى جمع الصور ، وخاصه عند تحليل الانسجه المعدنية. هنا ، يصف البروتوكول نموذجا محسنا لاستخدام الماوس قصاصات مع العظام بعد الولادة (حتى 6 أشهر من العمر) ، وتمكين البروتينات الفلورية لتكون تصور مباشره من قبل المجهر البؤري دون الحاجة إلى المناعة. يمكن تطبيق هذا البروتوكول المبسط علي الانسجه غير المعدنية. وعلاوة علي ذلك ، وشملت وصفا لكيفيه تخزين العينات من أجل الحفاظ علي اشاره الفلورسنت لفتره طويلة من 3 سنوات علي الأقل. ويرد في الشكل 1موجز للبروتوكول.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم استخدام نموذج الحلويات علي نطاق واسع لدراسة انسجه الغضروف المعدنية12،13،14 ولوصف البروتوكول الأمثل. يمكن استخدام الفئران قصاصات2 مع نسخه واحده أو نسختين من اليل R26R-الحلويات لتربيه والتجارب. أعاده الدمج في الفئران مع اليل واحد من بناء 2.1 الدماغ سيعطي أربعه التسميات المحتملة: البروتين الفلوري الأحمر (تقديم العروض ، سيتوبلازمي) ، البروتين الفلوري الأصفر (yfp ، سيتوبلاسولي) ، البروتين الفلوري السماوي (الباسيفيكي ، غشاء المترجمة) ، والأخضر البروتين الفلوري (GFP ، النواة المترجمة) ، في حين ان أعاده الدمج في الفئران المحتوية علي الورق (اي ، تحتوي علي نسختين من البناء 2.1 الدماغ) سوف تعطي 10 مخرجات اللون المحتملة (عروض التقديم + العروض ، العروض + YFP ، عروض التقديم + الباسيفيكي ، العطاء + GFP ، yfp GFP, س ف ب + اف بي اي, اف بي + GFP, GFP + GFP. ومع ذلك ، لان الختان الحمض النووي والاحداث الانقلاب تحدث بطريقه عشوائية ، أعاده تركيب لإنتاج GFP يحدث في جزء صغير فقط من الخلايا ، كما ذكرت سابقا2، ويختلف علي ما يبدو من نوع الخلية أو خط cre المستخدمة2، 12,13. التالي ، نظرا لانخفاض حدوث الاحداث المعاد تجميعها مما يؤدي إلى التعبير GFP ، وسته مخرجات اللون هي الأكثر شيوعا في الفئران الحلويات المنزلية.
اعتبار مهم عند التخطيط للتجارب مع الماوس قصاصات هو العثور علي سلاله Cre مناسبه. أولا ، نظرا لان اليل الحلويات لديها العديد من مواقع loxp ، واحده الحدث أعاده اتحاد لا يستبعد الثاني4. وهذا يعني انه إذا تم تسميه خليه ويقسم لإنتاج نسخه من لون واحد ، حدث أعاده تركيب الثانية في واحده من خلايا ابنتها من شانه ان يولد لون مختلف ، التالي إخفاء التوسع الحقيقي النسيلي. التالي ، سلالات Cre لا يمكن الحث ، حيث يكون الانزيم نشطا دائما إذا كان المروج المطابق نشطا ، ليس من المستحسن. ثانيا ، في بعض السلالات التعبير من cre للالطبيعيه غالبا ما ياتي علي حساب البروتين الذاتية ، التالي خلق النمط الظاهري من تلقاء نفسها (علي سبيل المثال ، ل Prg4-GFPCreERT2 ضرب في سلاله الماوس التي الفئران الميناء اثنين من الاليلات15) ، لذلك نسخه واحده من اليل cre هو مرغوب فيه. وفي جميع التجارب الموصوفة ، حملت نسخه واحده من الCol2CreERT16 اما الذكر أو الام الأنثى لتوليد Col2CreERT: الفئران الحلويات ، كما هو موضح في13. بعد ذلك ، فان خصوصية خط Cre إلى نوع الخلية من الفائدة هو اعتبار هام. علي سبيل المثال ، Col2CreERT هو غضروفي ، ولكن تسميات العديد من السكان متميزة من الغضروفي في الغضروف بعد الولادة في وقت مبكر17. وأخيرا ، فان نشاط سلالات Cre مختلفه يمكن ان تتغير إلى حد كبير مع العمر الحيواني ، كما النشاط الذاتي لمروج تستخدم لتغييرات التعبير Cre ، حتى في الخلايا من نفس النوع (علي سبيل المثال ، Prg4-GFPCreERT2، والتي يمكن ان تتطلب زيادة عدد جرعات تاموكسيفين لتسميه خلايا المنطقة السطحية كما الفئران سن15).
وسوف تنعكس علي عدد من الخلايا المسمية من كميه تاموكسيفين نظرا, لذلك ليس من المرغوب فيه دائما لإعطاء الجرعة القصوى لان التمييز بين الاستنساخ من بعضها البعض قد يكون من الصعب. لان التعبير Cre سوف تختلف تحت تنظيم المروجين مختلفه وكذلك مع العمر, الجرعة تاموكسيفين سوف تحتاج إلى تعديل لتحسين وضع العلامات. ومن المهم ان نلاحظ ان الخلايا ليست علي الفور الفلورسنت عند التسبب في أعاده التركيب لان الوقت مطلوب لأعاده تركيبه لتحدث والبروتينات الفلورية الناتجة تتراكم بما فيه الكفاية للتصوير. وهناك حاجه إلى مجموعه واسعه من الساعات (بين 24 − 72 ح) ، والتي يبدو ان تتاثر خط Cre ، من نوع الخلية ، والعمر الحيواني. منذ تاموكسيفين يمكن ان تكون نشطه بيولوجيا بعد فتره طويلة من الاداره18 فمن المستحسن دائما للتحقق من كفاءه أعاده الجمع بدقه في كل نموذج.
خلال خطوه المجهر البؤري ، تتطلب أثاره البروتينات الفلورية من الورق اختراق الانسجه بواسطة ضوء الليزر. لان الانسجه المختلفة لها خصائص مختلفه ، ضوء الليزر قد لا تخترق أقسام سميكه 160 μm من جميع الانسجه. ومع ذلك ، يمكن استخدام هذه الأقسام سميكه لنمو الغضروف لوحه ، كما هو مستخدم في الشكل 2، الشكل 3. لاحظ ان كل المجهر مختلفه ، وانه من غير المرجح ان الإعدادات الموصوفة (الملف التكميلي 1) سوف تعمل تماما دون تعديلات طفيفه. واحد التحديات الرئيسية هو التمييز بين البروتينات الفلورية المختلفة لضمان عدم وجود تلوث من قناه إلى أخرى. علي سبيل المثال ، الاشاره في قناه YFP الناجمة عن الفلورية القادمة من GFP تتداخل بين قنوات YFP وعروض العروض. ويجب أيضا فحص قنوات YFP و القناات الباسيفيكية بعناية. ويمكن القيام بذلك بعده طرق. أولا ، يمكن تضييق نطاق انبعاثات الموجات الضوئية الفلورية التي يتم تسجيلها لكل بروتين فلوري. ثانيا ، يمكن ضبط قوه الليزر في تركيبه مع المكسب الرقمي تحسين الاشاره. في هذه الدراسة كانت هذه الخطوات كافيه ، ولكنها تعتمد علي اشاره فلورية قويه. وهذا يعني انه من الناحية النظرية ، يمكن ان تقلل معالجه الانسجه غير الفعالة من نشاط البروتينات الفلورية ، أو يمكن ان يضعف مصدر ضوء الليزر الضعيف فصل القناة.
واحده من مزايا الماوس قصاصات هو انه يمكن الجمع بينها وبين عدد كبير من سلالات متحولة وراثيا التي تتوفر بحيث يمكن دراسة تاثير الجينات محدده علي ديناميات النسيلي10،11،12 ،13،14،19،20، وان كان مع بعض القيود. علي سبيل المثال ، لا يمكن فصل أعاده تركيب الكللات الحلويات وجين الفائدة عند استخدام المسوخ المستندة إلى Cre loxP مع تتبع النسب الكلونال. ومع ذلك ، يمكن ان تكون هذه الاحداث المتزامنة أعاده تشكيل فعاله10،14،20. علي سبيل المثال ، تم استخدام هذه الامكانيه لاستكشاف زيادة عدد الخلايا في منطقه الراحة من الفئران بعد الاستئصال بعد الولادة غضروفي محدده من TSC1 في لوحه النمو21 وكشفت العلاقة النسيلي بين هذه الخلايا مع مرور الوقت 13. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن استخدام تحليل النسيلي الانسجه الخاصة باستخدام الفئران قصاصات الورق مع الفئران متحولة غير cre loxp القائم علي11، وانه من الممكن أيضا الجمع بين هذه النهج مع الدوائية8،9 ،13 و/أو النماذج الجراحية8 لتصور الاستجابات النسيلي لاضطرابات وظيفية أخرى. المزيد من الفرص تنشا عند الجمع بين المقاطع المسمية قصاصات مع المناعة من البروتينات الذاتية عن طريق المناعي. ويسمح هذا التحليل بتحديد الخلايا المتتبعة والتنظير الحراري بعلامة معروفه. مع طريقه التثبيت الموصوفة هنا ، فمن الممكن لاجراء المناعي ولا تزال تصور الفلوري من البروتينات الفلورية قصاصات12،13. ومع ذلك ، في الورقات المذكورة ، لم يكن مطلوبا استرداد antigen. أساليب استرداد مستضد القاسية ، مثل الغليان في العازلة سيترات ، يؤدي إلى فقدان كامل من الفلورية القصاصات. علي الرغم من انه يمكن بعد ذلك الكشف عن البروتينات الفلورية كونفيتي باستخدام الأجسام المضادة22، يمكن ان يحدث فقدان الهوية النسيلي.
وباختصار ، فان استخدام نموذج الحلويات لتسميه الخلايا في الجسم الخارجي هو أداه معلوماتية لتحليل مصير تلك الخلايا مع مرور الوقت. توفر الطريقة الموصوفة طريقه سريعة وفعاله لتصور تعبير البروتين الفلوري بشكل مباشر في الانسجه المعدنية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور ايفغيني ايفاشكين علي المشورة المنهجية. وقد حظي هذا العمل بالدعم المالي من مجلس البحوث السويدي (ا. س. ج) ، والمؤسسة العلمية الروسية (منحه #19-15-00241 إلى ASC) ، ومعهد كارنسكا (A.S.C.) ، وسترارغين كي ، ستيفتيلسين كوننغ غوستاف بي اس 80-årsfond (A.S.C.) ، ستيفتيلسين Frimurare بارنهوسيت و Sallskapet Barnavard (P.T.N.) ، المجلس الصيني للمنح الدراسية (B.Z.). تم تمويل المجهر البؤري من قبل كنوت ومؤسسه اليس فالينبرغ.
Materials
| 2,2-thiodiethanol | Sigma | MKCF9328 | |
| 60 mm-long cover slips | Mendel-Gläzer | 220588 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | |
| Cryomold (standard) | Sakura | 4557 | |
| Cryostat | Thermo | Model: NX70 | |
| Disposable cryostat blades | Histolab | 207500014 | Specifically for use with hard tissue |
| EDTA | Scharlan | AC0960005P | |
| Formaldehyde concentrate | Merck | 8.18708.1000 | |
| Glass bottles | Sigma | V7130 | Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing |
| Imaris software | Oxford Instruments | N/A | Image analysis software for 3D reconstruction |
| Isoflurane | Zoetis | 11-8162 | |
| OCT | Sakura | 102094-104 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| PBS | Gibco | 14200075 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1.06498.1000 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost UltraPlus slides | Mendel-Gläzer | J3800AMNZ | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Zen2 software | Zeiss | N/A | Freeware for Confocal laser scanning microscopy |
References
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Proudfoot, N. J. Ending the message: poly(A) signals then and now. Genes & Development. 25 (17), 1770-1782 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Füllgrabe, A., et al. Dynamics of Lgr6+ Progenitor Cells in the Hair Follicle, Sebaceous Gland, and Interfollicular Epidermis. Stem Cell Reports. 5 (5), 843-855 (2015).
- Lazzeri, E., et al. Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury. Nature Communications. 9 (1), 1344 (2018).
- Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
- Yoo, Y. A., et al. The Role of Castration-Resistant Bmi1+Sox2+ Cells in Driving Recurrence in Prostate Cancer. Journal of the National Cancer Institute. 111 (3), 311-321 (2018).
- McConnell, A. M., et al. p53 Regulates Progenitor Cell Quiescence and Differentiation in the Airway. Cell Reports. 17 (9), 2173-2182 (2016).
- Li, L., et al. Superficial cells are self-renewing chondrocyte progenitors, which form the articular cartilage in juvenile mice. Faseb Journal. 31 (3), 1067-1084 (2017).
- Newton, P. T., et al. A radical switch in clonality reveals a stem cell niche in the epiphyseal growth plate. Nature. 567 (7747), 234-238 (2019).
- Kaucka, M., et al. Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage. eLife. 6, 25902 (2017).
- Kozhemyakina, E., et al. Identification of a Prg4-expressing articular cartilage progenitor cell population in mice. Arthritis Rheumatology. 67 (5), 1261-1273 (2015).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreERT to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Developmental Dynamics. 235 (9), 2603-2612 (2006).
- Mizuhashi, K., et al. Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells. Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).
- Reinert, R. B., et al. Tamoxifen-Induced Cre loxP Recombination Is Prolonged in Pancreatic Islets of Adult Mice. PloS One. 7 (3), 33529 (2012).
- Kim, I. S., et al. In vitro response of primary human bone marrow stromal cells to recombinant human bone morphogenic protein-2 in the early and late stages of osteoblast differentiation. Development, Growth & Differentiation. 50 (7), 553-564 (2008).
- Fang, X., Gyabaah, K., Nickkholgh, B., Cline, J. M., Balaji, K. C. Novel In Vivo model for combinatorial fluorescence labeling in mouse prostate. The Prostate. 75 (9), 988-1000 (2015).
- Newton, P. T., Xie, M., Medvedeva, E. V., Sävendahl, L., Chagin, A. S. Activation of mTORC1 in chondrocytes does not affect proliferation or differentiation, but causes the resting zone of the growth plate to become disordered. Bone Reports. 8, 64-71 (2018).
- Xie, M., et al. Schwann cell precursors contribute to skeletal formation during embryonic development in mice and zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (30), 15068-15073 (2019).
