Rastreamento genético clonal usando o mouse confetti para estudar tecidos mineralizados
Summary
Este método descreve o uso do modelo do rato do R26-confetti (confetti) para estudar tecidos mineralizado, cobrindo todas as etapas da estratégia de melhoramento à aquisição da imagem. Incluído é um protocolo geral que pode ser aplicado a todos os tecidos moles e um protocolo modificado que pode ser aplicado a tecidos mineralizados.
Abstract
Rotulando uma célula individual no corpo para monitorar quais tipos de células ele pode dar origem e rastrear sua migração através do organismo ou determinar sua longevidade pode ser uma maneira poderosa de revelar mecanismos de desenvolvimento e manutenção de tecidos. Uma das ferramentas mais importantes atualmente disponíveis para monitorar células in vivo é o modelo de mouse confetti. O modelo do Confetti pode ser usado para etiquetar genetically pilhas individuais em ratos vivos com várias proteínas fluorescentes em uma maneira tipo-específica da pilha e para monitorar seu Fate, assim como o Fate de seu progênie sobre o tempo, em um processo chamado traçado genético clonal ou traçado de linhagem clonal. Este modelo foi gerado há quase uma década e contribuiu para uma melhor compreensão de muitos processos biológicos, particularmente relacionados à biologia de células-tronco, desenvolvimento e renovação de tecidos adultos. No entanto, preservar o sinal fluorescente até a coleta de imagens e a captura simultânea de vários sinais fluorescentes é tecnicamente desafiador, especialmente para o tecido mineralizado. Esta publicação descreve um protocolo passo-a-passo para o uso do modelo confetti para analisar a cartilagem da placa de crescimento que pode ser aplicada a qualquer tecido mineralizado ou não mineralizado.
Introduction
Os métodos melhorados para monitorar o comportamento da pilha são desejáveis aumentar a eficiência experimental ao usar modelos animais. Uma das abordagens mais informativas para monitorar o comportamento celular in vivo é o rastreamento de linhagem clonal com cepas de mouse multicolor repórter1, incluindo o amplamente utilizado R26-confetti (confetti) mouse2. Através da rotulagem genética de células individuais com proteínas fluorescentes e seguindo essas células ao longo do tempo, pesquisadores em muitos campos usaram o mouse confetti para revelar insights sobre uma infinidade de diferentes sistemas biológicos.
O rato do Confetti é um sistema loxp-baseado do repórter em que o recombinação dependente do ADN de CRE causa a expressão permanente de uma de diversas proteínas fluorescentes possíveis em uma maneira estocástico2. O alelo do R26-confetti inclui o promotor ubiquitously expresso de cagg, que se encontra imediatamente a montante de umR-Cassette neo loxp-flanked2, cuja a seqüência do poliadenilação termine a transcrição3, seguida pelo Brainbow 2,1 construir4. Daqui, o recombinação CRE-negociado simultaneamente impostos especiais consumo aR-gaveta neo e conduz à produção de determinadas proteínas fluorescentes dependendo de que partes da construção de brainbow 2,1 são extirpada. Esta característica faz o rato do confetti extremamente adaptável porque pode ser usado para alvejar toda a população celular em um rato para que uma tensão específica de CRE está disponível. O cruzamento de uma estirpe CRE tecido-específica com a estirpe de R26-confetti fornece a especificidade da rotulagem. No entanto, a cepa CRE também deve ser induzível (por exemplo, creert ou CreERT2, que necessitam de ligação tamoxifeno para permitir que eles entrem no núcleo e induzem recombinação de DNA5) para que a rotulagem pode ser alcançada em pontos de tempo especificado. Assim, uma população celular pode ser rotulada injetando a prole resultante CreERT-positivo/confetti-positivo com tamoxifeno no ponto de tempo desejado e rastreada até uma certa idade, quando os tecidos de interesse podem ser coletados para análise. Após o processamento tecidual, as células com rótulo fluorescentamente podem ser visualizadas diretamente pela microscopia confocal, de modo que a progêia de cada célula inicialmente rotulada possa ser separada da descendência gerada por qualquer outra célula identificada com base em sua fluorescência específica rótulos, permitindo assim a avaliação da clonalidade (ou seja, rastreamento genético clonal).
Devido à flexibilidade do modelo de confetes, tem sido aplicado para estudar o desenvolvimento e a manutenção de diversos tecidos na saúde e na doença2,6,7,8,9, 10,11. Uma maneira comum de usar o modelo é rotular uma determinada população de células e determinar quais tecidos eles (e/ou sua descendência) contribuíram para. Um tal achado usando esta aproximação era que o dente adulto é compreendido das pilhas com uma origem glial6. Outra aplicação do modelo é estudar a homeostase de células-tronco. Por exemplo, o modelo confetti revelou que nichos de células-tronco nas criptas intestinais gradualmente se tornam monoclonais porque alguns clones de células-tronco são dominantes durante a competição entre as células-tronco2. O modelo também pode ser usado para avaliar a proliferação celular, o que é particularmente útil para estudar lentamente dividindo as células. Por exemplo, a formação clonal na cartilagem articular12 foi avaliada, e os efeitos a curto prazo de um antagonista de ouriço em condrócitos de placa de crescimento em camundongos de cinco semanas de idade foram estudados13.
Apesar da relativa simplicidade do modelo Confetti, o sinal fluorescente pode ser tecnicamente desafiador para preservar até a coleta de imagens, particularmente ao analisar os tecidos mineralizados. Aqui, o protocolo descreve um modelo otimizado para usar o mouse confetti com o osso pós-natal (até 6 meses de idade), permitindo que as proteínas fluorescentes sejam visualizadas diretamente pela microscopia confocal sem a necessidade de imunodetecção. Este protocolo simplificado pode ser aplicado a tecidos não mineralizados. Além disso, é incluída uma descrição de como armazenar as amostras, a fim de preservar o sinal fluorescente por um período prolongado de pelo menos 3 anos. Um esboço do protocolo é apresentado na Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
O modelo de confetti foi utilizado extensivamente para o estudo dostecidos de cartilagemmineralizada12,13,14 e para descrever o protocolo otimizado. Os ratos2 do confetti com uma cópia ou duas cópias do ALELO do R26-confetti podem ser usados para produzir e experimentos. Recombinação em camundongos com um alelo da construção Brainbow 2,1 dará quatro rótulos potenciais: proteína fluorescente vermelha (RFP, citoplasmática), proteína fluorescente amarela (YFP, citoplasmática), proteína fluorescente ciano (CFP, membrana localizada) e verde proteína fluorescente (GFP, núcleo-localizado), enquanto recombinação nos camundongos confetti homozygous (ou seja, contendo duas cópias da construção Brainbow 2,1) dará 10 saídas de cor possíveis (RFP + RFP, RFP + YFP, RFP + CFP, RFP + GFP, YFP + YFP, YFP + CFP, YFP + GFP, PCP + PCP, PCP + GFP, GFP + GFP). Entretanto, porque os eventos da excisão e da inversão do ADN ocorrem em uma maneira estocástico, o recombinação para produzir GFP ocorre em somente uma fração pequena das pilhas, como relatado previamente2, e difere aparentemente pelo Cell-Type ou pela linha de CRE usada2, 12,13. Assim, dada a baixa ocorrência de eventos de recombinação que levam à expressão do GFP, seis saídas de cor são as mais comuns em camundongos homozzygous confetti.
Uma consideração importante ao planejar experimentos com o mouse Confetti é encontrar uma cepa CRE adequada. Primeiro, uma vez que o alelo confetti tem vários sites loxP, um evento de recombinação não exclui um segundo4. Isso significa que se uma célula é rotulada e divide para produzir um clone de uma cor, um segundo evento de recombinação em uma de suas células filhas geraria uma cor diferente, mascarando assim a expansão clonal verdadeira. Assim, cepas não inducible CRE, onde a enzima está sempre ativa se o promotor correspondente está ativo, não são aconselháveis. Em segundo, em algumas tensões a expressão de CRE recombinase vem frequentemente à custa de uma proteína endógena, criando desse modo um phenotype do seus próprios (por exemplo, para o Prg4-GFPCreERT2 batida-na tensão do rato em que os ratos abrigam dois alelos do CRE15), assim uma única cópia do alelo CRE é desejável. Em todos os experimentos descritos, uma única cópia do Col2CreERT16 foi realizada tanto pelo macho quanto pelo pai feminino para gerar Col2CreERT: ratos confetes, conforme descrito13. Em seguida, a especificidade da linha CRE para o tipo de célula de interesse é uma consideração importante. Por exemplo, Col2CreERT é chondrocyte-specific, mas etiqueta diversas populações distintas dos condrócitos na cartilagem pós-natal adiantada17. Finalmente, a atividade de diferentes cepas de CRE pode mudar consideravelmente com a idade animal, pois a atividade endógena do promotor utilizado para alterações da expressão CRE, mesmo em células do mesmo tipo (por exemplo, Prg4-GFPCreERT2, que pode exigir um aumento número de doses de tamoxifeno para rotular células da zona superficial como camundongos com15anos de idade).
O número de pilhas etiquetadas será refletido pela quantidade de tamoxifeno dado, assim que não é sempre desejável dar a dose máxima porque distinguir clones de se pode ser difícil. Porque a expressão CRE irá variar a regulação de diferentes promotores, bem como com a idade, a dosagem de tamoxifeno terá de ser ajustado para otimizar a rotulagem. É importante notar que as células não são imediatamente fluorescentes ao desencadear recombinação porque o tempo é necessário para que a recombinação ocorra e as proteínas fluorescentes resultantes se acumulem suficientemente para a imagem. Uma escala larga das horas (entre 24 − 72 h) é precisada, que parece ser influenciada pela linha de CRE, pelo Cell-Type, e pela idade animal. Uma vez que o tamoxifeno pode ser biologicamente activo por muito tempo após a administração18 é sempre aconselhável verificar exaustivamente a eficiência de recombinação em cada modelo.
Durante a etapa da microscopia confocal, a excitação das proteínas fluorescentes do confetti exige a penetração do tecido pela luz do laser. Porque os tecidos diferentes têm propriedades diferentes, a luz do laser não pôde penetrar seções grossas de 160 μm de todos os tecidos. No entanto, essas seções grossas podem ser usadas para a cartilagem da placa de crescimento, como usado na Figura 2, Figura 3. Observe que cada microscópio é diferente e é improvável que as configurações descritas (arquivo complementar 1) funcionem perfeitamente sem pequenos ajustes. Um dos principais desafios é distinguir as diferentes proteínas fluorescentes para garantir que não haja contaminação de um canal para outro. Por exemplo, o sinal no canal YFP causado pela fluorescência proveniente do GFP se sobrepõe entre os canais YFP e RFP. Os canais do YFP e do CFP também devem ser cuidadosamente verificados. Isso pode ser feito de várias maneiras. Primeiramente, a escala da emissão de comprimentos de onda claros fluorescentes que são gravadas para cada proteína fluorescente pode ser estreitada. Em segundo lugar, ajustar a potência do laser em combinação com o ganho digital pode otimizar o sinal. Neste estudo estas etapas eram suficientes, mas confiam em um sinal fluorescente forte. Isto significa que, em teoria, o processamento de tecido ineficiente pode reduzir a atividade das proteínas fluorescentes, ou uma fonte fraca de luz laser pode prejudicar a separação de canais.
Uma das vantagens do mouse Confetti é que ele pode ser combinado com um grande número de cepas geneticamente mutantes que estão disponíveis para que o impacto de genes específicos na dinâmica clonal pode ser estudado10,11,12 ,13,14,19,20, embora com algumas limitações. Por exemplo, a recombinação dos alelos confetes e o gene de interesse não podem ser separados ao usar mutantes baseados em CRE loxP combinados com rastreamento de linhagem clonal. No entanto, tais eventos de recombinação coincidindo podem ser efetivos10,14,20. Por exemplo, esta possibilidade foi usada para explorar o número aumentado da pilha na zona de descanso dos ratos que seguem a ablação chondrocyte-específica pós-natal de TSC1 na placa21 do crescimento e revelaram a relação clonal entre estas pilhas sobre o tempo 13. Adicionalmente, a análise clonal tecido-específica que usa ratos do Confetti pode ser usada com os ratos do mutante do non-CRE loxp-baseados11, e é igualmente possível combinar estas aproximações com8,9 farmacológicos ,13 e/ou modelos cirúrgicos8 para visualizar respostas clonais a outras perturbações funcionais. As oportunidades mais adicionais levantam-se ao combinar seções etiquetadas confetti com imunodetecção de proteínas endógenas pela imunofluorescência. Tal análise permite a identificação de células rastreadas e sua colocalização com um marcador conhecido. Com o método de fixação aqui descrito, é possível realizar a imunofluorescência e ainda visualizar a fluorescência das proteínas fluorescentes do confete12,13. Entretanto, nos artigos mencionados, a recuperação do antígeno não foi exigida. Os métodos ásperos da recuperação do antígeno, tais como a ebulição no tampão do citrato, conduzem a uma perda completa da fluorescência do confetti. Embora as proteínas fluorescentes do confetti possam então ser detectadas usando anticorpos22, uma perda de identidade clonal pode ocorrer.
Em resumo, usar o modelo confetti para rotular células in vivo é uma ferramenta informativa para analisar o destino dessas células ao longo do tempo. O método descrito fornece uma maneira rápida e eficiente de Visualizar diretamente a expressão da proteína fluorescente em tecidos mineralizados.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Evgeny Ivashkin por conselhos metodológicos. Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Conselho de pesquisa Sueco (a. S. C), a Fundação científica russa (subvenção #19-15-00241 para ASC), Instituto Karolinska (A.S.C.), StratRegen KI e Stiftelsen Konung Gustaf V:s 80-årsfond (A.S.C.), stiftelsen Frimurare Barnhuset e Sallskapet Barnavard (P.T.N.), Conselho chinês da bolsa de estudos (B.Z.). O microscópio confocal foi financiado pela Fundação Knut e Alice Wallenberg.
Materials
| 2,2-thiodiethanol | Sigma | MKCF9328 | |
| 60 mm-long cover slips | Mendel-Gläzer | 220588 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | |
| Cryomold (standard) | Sakura | 4557 | |
| Cryostat | Thermo | Model: NX70 | |
| Disposable cryostat blades | Histolab | 207500014 | Specifically for use with hard tissue |
| EDTA | Scharlan | AC0960005P | |
| Formaldehyde concentrate | Merck | 8.18708.1000 | |
| Glass bottles | Sigma | V7130 | Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing |
| Imaris software | Oxford Instruments | N/A | Image analysis software for 3D reconstruction |
| Isoflurane | Zoetis | 11-8162 | |
| OCT | Sakura | 102094-104 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| PBS | Gibco | 14200075 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1.06498.1000 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost UltraPlus slides | Mendel-Gläzer | J3800AMNZ | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Zen2 software | Zeiss | N/A | Freeware for Confocal laser scanning microscopy |
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