ミネラル化組織を研究するために紙吹雪マウスを用いてクローン遺伝トレース

すべてのマウスの研究は、動物実験に関する倫理委員会(ストックホルム北部委員会/ノラ・ジュルフェルソクセツカ・ネムド)によって承認され、スウェーデン動物庁の動物実験に関する規定とガイドラインに従って実施されました。 1. マウスの繁殖 歪みを生成するには、R26R-Confettiマウスを対象のCreラインと交差させます。生後21歳の子犬を引き抜く。注:マウスは、約8週間の生後8週間から、または地元のガイドラインに従って繁殖するために使用することができます。ジェノタイピング(ここでは説明しない)は、離離で収集された生検から行うことができる。引き取り時の年齢は、地域のガイドラインに応わせて調整することができます。 2. 紙吹雪のラベリング 注:この標識戦略は、タモキシフェン誘導性クレ株に適しています。 ガラス瓶にトウモロコシ油で最大2.5mg/mLタモキシフェンの溶液を準備します。オーブンで37°Cに60分間加熱して溶解し、粉末が溶解するまで渦を使用して5分ごとに攪拌する。注:タモキシフェンの用量の増加のために、 20 mg/mLまでの溶液は、この方法を使用して調製することができます。 光から保護された最大3ヶ月間、4°Cで保管してください。 産後最初の日にトウモロコシ油に溶解した2.5mg/mLタモキシフェンの50 μLを経口投与して組換えを誘導する(P1)。注:原則として、タモキシフェンは、F1世代の早い時期に、任意の年齢で投与することができます。タモキシフェンの用量は、Cre発現、マウス年齢、および実験用途に基づいて変化させるべきである。詳細については、ディスカッション セクションを参照してください。同じ方法で処理されたクレ陰性マウスは、Confetti蛍光シグナルに対する陰性対照として用いることができる。注意:動物ハンドラーがタモキシフェンの使用について警告を受け、ケージ材料が地元の環境および安全ガイドラインに従って処分されていることを確認してください。 3. ティッシュコレクション 出生後27日目(P27)にマウスを安楽死させるには、少なくとも80%の体積で二酸化炭素を含む空間を徐々に充填し、この濃度を3分間維持して子宮頸部転位を行う。他の動物の解剖中に氷の上にマウスを保つ。 目的の組織を解剖する。以下に概説は、6ヶ月までの出生後マウスに適した膝の近位脛骨および遠位大腿骨成長プレートおよび関節軟骨を収集するためのプロトコルである。 鋭いはさみと歯の鉗子を使用して、足まで後肢の周りの皮膚を取り除きます。 鋭いはさみで脚から筋肉と脂肪組織を大まかにトリミングします。注:周囲の組織は断面時に構造的なサポートを提供しますが、すべての皮膚が除去されていることを確認するため、骨を完全にきれいにしないでください。 メスを使用して、大腿骨の頭部が見えるまで脚の上部が体と出会う柔らかい組織を切り取り、その後、股関節の靭帯を切断して脚を取り除きます。注:あるいは、大腿骨の頭部を見つけ出することができない場合は、強いはさみで股関節に近い大腿骨を切り取る。 メスや鋭いはさみを使って脚の残りの部分から足を解剖します。 4. 組織の固定と処理 注:目的の組織に基づいて、以下に説明する2つのプロトコルのいずれかに従ってください(軟部組織の場合は4.1、または4.2は、以下に詳述するように、約45日間のミネラル化マウス組織の場合)。いずれの方法でも、残りの動物を解剖しながら、3.7%ホルムアルデヒド/リン酸緩衝生理食生(PBS)溶液に解剖したサンプルを氷上に保存します。 約P45の年齢までの軟部組織およびミネラル化された脛骨およびフェモラのために、6時間の予冷化された3.7%ホルムアルデヒド/PBSの組織を固定し、4°Cで回転子に穏やかに転がす。組織の10倍以上の体積を使用してください。手順 4.3 に直接進む。 約P45の年齢にわたって脛骨およびフェモラを含むミネラル化組織のために、脱石化ステップが必要である。 水酸化ナトリウムを用いて8.05に調整したpHで10TA/dH2O溶液の1Lを調出します。次に、この溶液を使用してホルムアルデヒドを3.7%に希釈する。EDTAの稼働率は9%となります。 一晩3.7%ホルムアルデヒド/PBSを予冷させ、4°Cで回転子をゆっくりと転がして組織を固定します。 組織を予冷させた3.7%ホルムアルデヒド/9TA/dH2O溶液(pH 8.05)に入れ、組織の10倍以上の体積で4°Cで穏やかに回転させます。骨を新鮮な予冷化 3.7% ホルムアルデヒド/9% EDTA/dH2O に次の 48 時間にわたって 3 倍に置いて、この手順を繰り返します。注:この短いデカール化は、生後6ヶ月までのマウスの大腿骨と脛骨の骨の切除を可能にするのに十分です。より密にミネラル化された組織のために、さらに脱石化は組織学を改善するために必要とされてもよい。 組織を予冷させた30%ショ糖/dH2O.に移し、容器をつばに充填し、4°Cで一晩ゆっくりと回転させます。組織の10倍以上の体積を使用してください。組織は、最初にこの溶液に入れたときにしばしば浮かび、朝までにボトルの底に沈みます。 残留スクロース溶液を除去するには、スクロース溶液から鉗子で取り出し、サンプルを約5mlの最適切断温度化合物(OCT)で数秒間完全に覆って洗浄します。 OCTであらかじめラベル付けされたクライモルドを塗り、下部に組織を配置します。サンプルが室温に長時間座りすぎないように素早く作業してください。注: 断面ステップに適した向きでサンプルを配置することが重要です。Col2CreERT:Confettiでトレースした後、成長板の柱全体を通して断面する可能性を高めるために、大腿骨の頭部をガイドとして下向きに中間側を配置し、サンプルを可能な限り金型の底に平らに配置します。 ドライアイスの上に金型を置き、OCTが完全に固化するのを待つことによってサンプルを埋め込みます。金型内の組織の動きや滑りを避けるために、クライモルドをできるだけ平らに置きます。完成したら、すぐに使用しない場合は-20°Cで保存してください。注:年齢とともにブロックがセクションに困難になるので、12週間以内に使用してください。 5. 断面 注:硬い組織に適した使い捨てブレードを持つクライオスタットを使用して凍結切除を行います。任意の標準的なクライオスタットが適しています。 ブロックを金型から取り出し、ブロックの上部とチャックの間にOCTを塗布し、少なくとも5分間-20°Cでクライオスタットで冷却して、OCTが完全に固化するようにチャックに固定します。 サンプルホルダーとブレードホルダーの両方を-20°Cに予冷させ、サンプル/チャックをチャックホルダーに入れ、ブレードホルダーにブレードを入れ、数分間平衡させます。注:指定された温度は、クライオスタットおよび目的の組織に応じて数度変化してもよい。 クライオスタットを使用して、適切な厚さのブロックをトリミングし、目的の組織内のクローンの視覚化を可能にする組織セクションを切断します。 出生後の成長プレート分析では、30−160 μmのセクションを準備し、スライド上で収集します。一部のクライオスタットモデルでは、トリム設定を使用して厚いセクションの収集のみを許可する場合があります。 完全に乾燥するまで、スライドを室温で乾燥させます。注:このステップの持続時間は、組織の特性と断面の厚さに基づいて変化する可能性があります。部屋の温度はまた、このステップの速度に影響を与える可能性があります。 スライドを -20 °C に最大 36 か月間保管するか、すぐに処理する場合は、手順 6.2 に進みます。 6. スライドの準備と取り付け 冷凍庫からスライドを取り外し、スライドホルダーで水平に室温まで持ち上げます。任意の結露が蒸発することを許可します。 パストゥールピペットを使用して、室温でPBSをスライドに静かに塗布してOCTを取り除きます。断面が厚いほど、時間が長くなります。160 μmの厚さのセクションの場合は、2つのすすりを行います:15分間インキュベートし、液体を除去し、5分間新鮮なPBSを適用し、液体を除去します。注:このステップは、OCTを除去するものであり、必要に応じて組織特性およびセクションの厚さに基づいて変化させることができる。部屋の温度は、このステップの速度に影響を与える可能性があります。 60 mm の長いカバー スリップを持つ室温で 75% 2,2 チオジエノール/dH2O の溶液にスライドを取り付けます。注:スライドは、イメージングの直前に準備することができますが、蛍光信号は4°Cで加湿室内の光の外に保たれた場合、1〜2週間安定しています。 7. 共焦点顕微鏡によるイメージング 顕微鏡を設置します。 顕微鏡の電源を入れ、ソフトウェアを開きます。[システムの開始]ボタンをクリックします。 [取得]タブの [スマート セットアップ]をクリックし、赤色蛍光タンパク質 (RFP)、黄色蛍光タンパク質 (YFP)、シアン蛍光タンパク質 (CFP) の下にある 3 つのチャネルを選択して、チャネルを選択します。染料の見出し。[最適信号]をクリックし、[適用]をクリックしてレーザーを選択します。注: [取得]タブの内容は、補足ファイル 1Aに表示されます。必要なチャネルが存在しない場合は、[色分け] 見出しの下にある [+’ ボタンを使用して追加します。レーザー、励起波長、および記録された発光波長の範囲に関する必要な情報は、補足ファイル1B-Dの3つのConfetti蛍光タンパク質について示されている。 [取得モード]タブで[目的見出し]の下にある20倍の対物レンズを選択します。 成長板または目的の他の組織を見つけます。 個別のビューを提供するには、まず[チャネル]タブでその名前をクリックして RFP チャンネルを選択します。これにより、RFP チャネルの詳細が[ライト パス]タブに表示されます。 注:T-PMTチャネルは、組織の非蛍光部を可視化するために使用される非反射レーザー光を示す。 スライドホルダーにスライドを配置し、光路と対物レンズの間に直接成長板または他の組織を配置します。 組織のローカライズを簡略化するには、[チャンネル] タブの [トラック]タブの下にあるチェック ボックスを使用して、YFP チャネルと CFP チャネルの選択を解除します。 トラック見出しで T-PMT チャンネルの名前をクリックして、T-PMT チャンネルを選択します。[取得]タブで[ライブ]をクリックし、T-PMT チャネルのゲイン (マスター)を増やして、画面上のティッシュ セクションをグレースケールで表示します。 ジョイスティックを使用してスライドの位置を移動して目的の領域を特定し、適切な顕微鏡ノブを使用してフォーカスします。 [取得]タブの [停止]をクリックして、レーザーの露出をオフにします。 イメージング パラメータを定義します。 [チャンネル]タブのチェック ボックスを使用してチャンネルの 1 つを選択し、[取得]タブで[ライブ]をクリックして、そのチャンネルの画像を画面に表示します。次に、マウスの左クリックボタンを使用して、スライドバーを調整して、収集された発光信号の範囲、レーザーパワー(レーザー針路の下のスライドバー)、ゲイン(マスター)、デジタルオフセット[チャンネル]タブを使用して、画面上の [紙吹雪] ラベル付きセルを視覚化します。これらのパラメーターのガイドライン値は、RFP、YFP、および CFP の補足ファイル 1B-Dで提供されます。すべてのチャネルに対して、1 つずつこの手順を完了します。注:可視化された信号が自己蛍光でないことを確認するために、Cre陰性動物のセクションをこのステップの間に負のコントロールとして使用することができます。T-PMT は RFP レーザー(ステップ 7.2.1)と組み合わされ、RFP のレーザーパワーを調整すると、T-PMT 信号に影響します。 必要に応じて、ピンホールサイズを調整して蛍光検出を増やします。注:ピンホールサイズが大きいほど、Z方向に蛍光信号が検出されます。このガイドラインは、ピンホールインジケータの下に自動的に表示される結果のAiryユニット(AU)で、1 AUはイメージング品質に最適です。AU を大きくしすぎると、Z 方向の個々のセルを区別することが難しくなるため、後で分析が損なわれます) 設定を確認して、記録された信号が重複していないことを確認します。 [チャネル]タブのチェックボックスをクリックして3つのチャンネルをすべて選択し、[取得]タブの[スナップ]ボタンを押します。 結果の画像では、[ディメンション]タブに表示されている各チャンネルの上にある青いハイライト表示されたボックスをクリックして、表示されたチャンネル間をスクロールします。信号が重なっている場合(例えば、すべての赤いセルも黄色の場合)、ステップ7.3の先頭に戻り、重なり合うチャネルのパラメータを互いに区別できるまで調整します。ラベルごとに(RFP、YFP、または CFP)ごとに、ラベルの 1 つだけを含む少なくとも 1 つのクローンを視覚化できることを確認します。 画像を取得します。 [取得モード]タブを選択して、[フレームサイズ]、[速度]、および[平均数]値を使用して画質を指定します。注: これらの実験の一般的な設定は、補足ファイル 1Aに示されています。[取得]タブ内の[スキャン領域]見出しの下のズームを小さくすると、画像取得に必要な時間を変更せずに視野を拡大できます。 [取得]タブで、[寸法取得]見出しの下にある Zスタックチェック ボックスをクリックします。Zスタックタブを開き、Z 方向の画像間の間隔を 2.5 μm に設定します。 正しい位置を設定するには、[チャンネル]タブで RFP/T-PMT のみを選択し、[ライブ]をクリックして、組織の輪郭が表示された赤いクローンを視覚化します。対応するスライスの [最初に設定]をクリックし、[最後に設定]をクリックして、顕微鏡ノブを使用してフォーカスを調整して、最初と最後のスライスを設定します。 [取得]タブの [タイル スキャン]タブをクリックし、それぞれのボックスに水平方向と垂直方向のタイルの合計数を入力します。 画像キャプチャの場合は、[チャンネル]タブで目的のチャンネルをすべて選択し、[スナップ]ボタンをクリックして単一の画像を収集するか、[実験開始]ボタンをクリックしてZスタック/タイルスキャンを収集します。 画像を取得したら、[ファイル] をクリックし、[名前を付けて保存]をクリックし、顕微鏡の設定に関する情報をできるだけ多く保持するファイルタイプに画像を保存し、後で確認して再利用できるようにします。 画像解析ソフトウェアを使用してさらなる解析を行います。