מעקב גנטי שבטים באמצעות עכבר קונפטי למחקר רקמות מינרליזציה

כל העבודה בעכבר אושרה על ידי ועדת אתית על ניסויים בעלי חיים (ועדת שטוקהולם צפון/Norra Dörtiska Nämd) ובוצעו בהתאם הוראות הסוכנות לבעלי חיים שוודית ́s הנחיות לניסויים בבעלי חיים. 1. רבייה של העכבר כדי ליצור את הנבג, חצה את העכבר R26R-קונפטי עם קו הריבית של היין. . לגמול את הגורים בגיל 21הערה: ניתן להשתמש בעכברים לצורך רבייה מגיל 8 שבועות, או לפי ההנחיות המקומיות. הקלדה (לא מתוארת כאן) ניתן לבצע מתוך ביופסיות שנאספו בגמילה. הגיל בגמילה יכול להיות מותאם לפי ההנחיות המקומיות. 2. מדבקת קונפטי הערה: זו אסטרטגיה תיוג מתאים טמוקסיפן inducible הזנים. הכינו פתרון של עד 2.5 מ”ג/מ”ל טמוקסיפן בשמן תירס בבקבוק זכוכית. התמוססות באמצעות חימום ל-37 ° c בתנור למשך עד 60 דקות, מתוך כל 5 דקות באמצעות מערבולת עד שהאבקה מתמוססת.הערה: עבור מינונים מוגברת של טמוקסיפן, פתרונות עד 20 מ”ג/mL ניתן להכין באמצעות שיטה זו. חנות ב -4 ° c עד 3 חודשים, מוגן מפני אור. לגרום שילוב מחדש על ידי ניהול 50 μl של 2.5 mg/mL טמוקסיפן מומס intraperitoneally שמן תירס ביום הראשון לאחר הלידה (P1).הערה: בעיקרון, ניתן לערוך את טמוקסיפן בכל גיל, מוקדם ככל הדור F1. המינון של טמוקסיפן צריך להיות מגוון מבוסס על ביטוי היצור, גיל העכבר, ויישום ניסיוני. מידע נוסף ניתן למצוא בסעיף הדיונים. יצורים שליליים שטופלו באותו אופן יכול לשמש כפקד שלילי עבור אותות פלורסנט קונפטי.התראה: הקפדה על מטפלים בבעלי חיים מוזהרים מהשימוש בטמוקסיפן ומבטיחים שחומרי הכלוב מושלך על פי הנחיות הסביבה והבטיחות המקומיות. 3. אוסף רקמות עכברים המתת חסד על יום לידה 27 (P27) על ידי מילוי בהדרגה את החלל המכיל את העכברים עם דו תחמוצת הפחמן עד לפחות 80% על ידי נפח ושמירה על ריכוז זה עבור 3 דקות. לבצע פריקה צוואר הרחם. לשמור על העכבר על הקרח במהלך הניתוח של החיות האחרות. . מנתח את רקמת העניין המתואר להלן פרוטוקול לאיסוף לוחיות הצמיחה הקרובים ביותר והירך התיכון והסחוס העצמי של הברך, מתאים לעכברים לאחר הלידה עד גיל 6 חודשים. להסיר את העור סביב הגפיים האחוריות ככל הרגל, באמצעות מספריים חדים מלקחיים שיניים. בערך לקצץ את השריר ואת רקמת השומן מהרגליים עם מספריים חדים.הערה: אל תנקה את העצמות בצורה מושלמת, מכיוון שהרקמות המקיפות מספקות תמיכה מבנית כלשהי, אך הקפד להסיר את כל העור. באמצעות אזמל, חותכים את הרקמה הרך שבו החלק העליון של הרגל פוגש את הגוף עד הראש הירך הוא גלוי, ואז לחתוך את הרצועות במפרק הירך כדי להסיר את הרגל.הערה: לחלופין, אם לא ניתן למצוא את ראש הירך, לחתוך דרך עצם הירך קרוב הירך עם מספריים חזקים. לנתח את הרגל משאר הרגל באמצעות אזמל או מספריים חדים. 4. קיבוע רקמות ועיבוד הערה: בהתבסס על רקמת הריבית, בצע את אחד משני הפרוטוקולים המפורטים להלן (4.1 עבור רקמות רכות או 4.2 עבור רקמות עכבר מינרליזציה מעל גיל של כ 45 ימים, כמפורט להלן). עבור שתי השיטות, לאחסן את הדגימות גזור ב-3.7% פורמלדהיד/פוספט באגירה מלוחים (PBS) פתרון על הקרח בזמן מנתח את שאר החיות. עבור רקמות רכות ומינרליזציה ולפטואה עד גיל של כ P45, לתקן את הרקמה ב מקורר 3.7% פורמלדהיד/PBS עבור 6 h, מתגלגל בעדינות על מסובבי ב 4 ° c. השתמש באמצעי אחסון לפחות 10x גדול יותר מאשר זה של הרקמה. המשך ישירות לשלב 4.3. עבור רקמות מינרליזציה, כולל החיברות והפמורה מעל גיל P45, נדרש שלב הדאלסימפיקציה. להכין 1 L של 10% EDTA/dH2O פתרון עם pH מותאם 8.05 באמצעות נתרן הידרוקסיד. הבא, לדלל את פורמלדהיד כדי 3.7% באמצעות פתרון זה. ריכוז העבודה של EDTA יהיה 9%. תקן את הרקמה על ידי הצבת לתוך מקורר 3.7% פורמלדהיד/PBS לילה, מתגלגל בעדינות על מסובבי ב 4 ° c. מניחים את הרקמה לתוך מקורר 3.7% פורמלדהיד/9% EDTA/dH2O פתרון (pH 8.05), ולסובב בעדינות ב 4 ° c בכרך לפחות 10x גדול יותר של הרקמה. חזור על שלב זה על ידי הצבת העצמות לתוך טרי, מקורר 3.7% פורמלדהיד/9% EDTA/dH2O עבור 3x מעל 48 h הבאה.הערה: decalcification קצר זה מספיק כדי לאפשר בנייה של עצמות הירך והשוקה של עד 6 חודשים-עכברים בני. עבור רקמות מינרליזציה בצפיפות נוספת decalcification נוספת עשויה להידרש כדי לשפר את היסטולוגיה. העבירו את הרקמה לתוך הקירור 30% סוכרוז/dH2O. הקפידו למלא את המיכל על הקצה, ולסובב בעדינות את הלילה ב -4 ° c. השתמש באמצעי אחסון לפחות 10x גדול יותר מאשר זה של הרקמה. הרקמה לעתים קרובות לצוף כאשר הניח הראשון לתוך הפתרון הזה ולשקוע לתחתית הבקבוק עד הבוקר. כדי להסיר את התמיסה השיורית, שטוף בקצרה את הרקמה על ידי הסרתם מפתרון הסוכות עם מלקחיים ומכסה לחלוטין את המדגם בקירוב של כ -5 מ ל של טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT) למשך מספר שניות. ממלאים cryomold התווית עם OCT ולמקם את הרקמה בתחתית. עבוד במהירות כדי למנוע את הדגימות היושבות בטמפרטורת החדר במשך זמן רב מדי.הערה: חשוב למקם את המדגם בכיוון נוח עבור השלב המתאים. כדי להגדיל את הסיכויים להציב באמצעות עמודות לוחית צמיחה שלמה לאחר מעקב עם Col2CreERT: קונפטי, למקם את הצד האמצעי הפונה למטה באמצעות ראש הירך כמדריך, ולמקם את המדגם כמו שטוח לתחתית העובש ככל האפשר. להטביע את המדגם על ידי הצבת העובש על הקרח היבש מחכה OCT כדי לגבש לחלוטין. מניחים את הקריובני שטוח ככל האפשר כדי למנוע תנועה/הזזה של הרקמה בתבנית. לאחר סיום, לאחסן את הדגימות ב-20 ° c, אם הם לא משמשים באופן מיידי.הערה: השימוש בתוך 12 שבועות, כי עם גיל הבלוקים הופכים קשים יותר לסעיף. 5. המשך המכירה הערה: ביצוע קריוסטט בהקפאה עם להבים חד פעמיים מתאים לרקמה קשה. כל הקריוסטט סטנדרטי מתאים. הסר את הבלוק מהעובש ואבטח אותו לצ על-ידי החלת OCT בין החלק העליון של הבלוק לבין צ’אק וצינון בקריוסטט ב-20 ° c לפחות 5 דקות, כך ש-OCT התחזק לחלוטין. לצנן הן את מחזיק המדגם ואת מחזיק הלהב ל-20 ° c ולאחר מכן למקם את המדגם/צ ‘ אק במחזיק צ’אק ואת הלהב במחזיק להב כדי להאביק עבור כמה דקות.הערה: הטמפרטורות שצוינו עשויות להיות מגוונות על-ידי מספר תארים, בהתאם לקריוסטט ולרקמת העניין. השתמש קריוסטט כדי לחתוך את הבלוק ולחתוך חתכים הרקמה של עובי מתאים כדי לאפשר ויזואליזציה של שיבוטים ברקמת הריבית. עבור ניתוח לוחית הצמיחה פוסט-לידה, הכינו סעיפים של 30-160 יקרומטר ואספו אותם על השקופיות. חלק מדגמי הקריוסטט עשויים לאפשר רק את אוסף המקטעים העבים באמצעות הגדרת הקיטום. האוויר יבש את השקופיות בטמפרטורת החדר עד שהם יבשים לחלוטין.הערה: משך שלב זה עשוי להשתנות בהתאם למאפייני הרקמה ועובי המקטע. הטמפרטורה של החדר עלולה גם להשפיע על מהירות שלב זה. אחסן את השקופיות ב-20 ° צ’ עד 36 חודשים, או אם העיבוד מיידי, המשך לשלב 6.2. 6. הכנת שקופיות והרכבה הסר את השקופית מהמקפיא והגדל את טמפרטורת החדר בתוך מחזיק שקופית. . הניחו לעיבוי כלשהו להתאדות הסר את ה-OCT על-ידי שימוש בפיפטה של פסטר כדי להחיל בעדינות את ה-PBS בטמפרטורת החדר על השקופית. ככל שהמקטע עבה יותר, יידרש זמן רב יותר. עבור 160 יקרומטר מקטעים עבים, לבצע שני rinses: הדגירה פעם אחת 15 דקות ולהסיר את הנוזל, ולאחר מכן להחיל ה-PBS טרי עבור 5 דקות ולהסיר את הנוזל.הערה: שלב זה הוא להסיר את ה-OCT והוא יכול להיות מגוון בהתבסס על מאפייני הרקמה ועל עובי המקטע, לפי הצורך. הטמפרטורה של החדר עשויה להשפיע על המהירות של שלב זה. הר את השקופיות בפתרון של 75% 2, 2-התאנואתנול/dH2O בטמפרטורת החדר עם 60 מ”מ מכסה כיסוי ארוך.הערה: ניתן להכין שקופיות מיד לפני ההדמיה, אך אות הפלורסנט יציב למשך 1 עד 2 שבועות, אם הדבר ממשיך לצאת מהאור בחדר מחולל ב -4 ° c. 7. הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית . הגדר את המיקרוסקופ הפעל את המיקרוסקופ ופתח את התוכנה. לחץ על הלחצן הפעל מערכת . בחר את הערוצים על ידי לחיצה ראשונה על תוכנית ההתקנה החכמה תחת הכרטיסיה רכישה ולאחר מכן בחירת שלושת הערוצים המתאימים חלבון פלורסנט אדום (rfp), חלבון פלורסנט צהוב (yfp), וחלבון פלורסנט ציאן (CFP) תחת ה כותרת צבע . לחץ על האות הטוב ביותר ואז להחיל כדי לבחור את לייזרים.הערה: התוכן של הכרטיסיה ‘ רכישה ‘ מוצג בקובץ משלים 1a. אם הערוצים הדרושים אינם נוכחים, הוסיפו אותם באמצעות הלחצן ‘+’ שמתחת לכותרת הצבע . המידע הדרוש לגבי לייזר, אורכי גל עירור, ומגוון אורכי גל פליטה מוקלט מוצג עבור שלושה חלבונים פלורסצנט בקובץ משלים 1B-D. בחר את העדשה האובייקטיבית של 20x תחת הכותרת האובייקטיבית בכרטיסיה מצב רכישה . לאתר את צלחת הצמיחה או רקמה אחרת של עניין. כדי לספק תצוגה מובחנת, בחר תחילה בערוץ RFP על-ידי לחיצה על שמו בכרטיסיה ערוצים . פעולה זו גורמת להצגת פרטי הערוץ RFP בכרטיסיה נתיב אור . לחץ על תיבת השנתות לצד T-PMT.הערה: ערוץ T-PMT מציג אור לייזר שאינו משתקף, המשמש להמחיש את החלקים הלא-פלואורסצנטי של הרקמה. מקם את השקופית במחזיק השקופיות ומקם את לוחית הצמיחה או רקמה אחרת של עניין ישירות בין הנתיב האור לבין העדשה האובייקטיבית. כדי לפשט את השימוש ברקמה, בטלו את הסימון בערוצים YFP ו-CFP באמצעות השנתות שמתחת לכותרת הלשונית של הערוצים . בחר בערוץ T-PMT על-ידי לחיצה על שמו בכותרת הרצועות . לחץ על Live בכרטיסיה רכישה והגדל את הרווח (מאסטר) עבור ערוץ T-PMT כדי להמחיש את מקטע הרקמה על המסך, המוצג בקנה מידה אפור. הזז את מיקום השקופית באמצעות ג’ויסטיק כדי לאתר את אזור הריבית, ולאחר מכן התמקד באמצעות כפתור המיקרוסקופ המתאים. לחץ על עצור בכרטיסיה רכישה כדי לבטל את חשיפת הלייזר. הגדירו את פרמטרי ההדמיה. השתמש בתיבות השנתות בכרטיסיה ערוצים כדי לבחור אחד מהערוצים ולחץ על Live בכרטיסיה רכישה כדי להציג את התמונה של אותו ערוץ במסך. לאחר מכן, באמצעות לחצן לחיצה שמאלית על העכבר, להתאים את שקופית שקופיות כדי להגדיר את הטווח של אות פלורסנט נפלט שנאסף, כוח הלייזר (הזזה בר תחת כותרת לייזרים ), להשיג (מאסטר) היסט דיגיטלי ב הכרטיסייה ‘ ערוצים ‘ כדי להמחיש את התאים המסומנים באמצעות קונפטי על המסך. ערכי קווים מנחים עבור כל הפרמטרים הללו ניתנים בקובץ משלים 1B-D עבור RFP, yfp ו-CFP. השלם את הצעד הזה עבור כל ערוץ, בזה אחר זה.הערה: כדי להבטיח שהאות הדמיין לא יהיה במצב של קרינה אוטומטית, מקטע מבעל חיים שלילי של היצורים יכול לשמש כפקד שלילי במהלך שלב זה. כמו T-PMT בשילוב עם לייזר RFP (שלב 7.2.1) התאמת כוח הלייזר עבור RFP ישפיע על האות T-PMT. התאימו את גודל הנקב כדי להגדיל את גילוי הקרינה במקרה הצורך.הערה: ככל שגודל החור גבוה יותר, האות הפלורסנט יותר מזוהה בכיוון Z. מנחה לכך היא היחידה האוורירית הנובעת (AU), המצוינת באופן אוטומטי מתחת למחוון Pinhole , כאשר 1 AU הוא אופטימלי לאיכות ההדמיה. הגדלת ה-AU הרבה יותר מדי יפגע בניתוח מאוחר יותר, מכיוון שהוא הופך להיות קשה יותר להבחין בין תאים בודדים בכיוון Z). בדוק את ההתקנה כדי לוודא שאותות מוקלטים אינם חופפים. לחץ על תיבות השנתות בכרטיסיה ערוצים כדי לבחור את כל שלושת הערוצים ולחץ על לחצן הצמד בכרטיסיה רכישה . בתמונה הנובעת, גלול בין הערוצים המוצגים על-ידי לחיצה על התיבות המסומנות בכחול מעל כל ערוץ מפורט בכרטיסיה מידות . בדוק באופן ידני את החפיפה בין הערוצים שעל המסך. אם האותות חופפים (לדוגמה, אם כל תא אדום הוא גם צהוב), חזור לתחילת שלב 7.3 וחזור על, התאמת הפרמטרים עבור הערוצים החופפים עד שניתן יהיה להבדיל זה מזה. ודא שלכל תווית (כלומר, RFP, YFP או CFP), לפחות שיבוט אחד יכול להיות מדמיינו שמכיל רק אחת מהתוויות. לרכוש תמונה. בחרו בכרטיסייה ‘ מצב רכישה ‘ כדי לציין איכות תמונה בעזרת האפשרות ‘ גודל מסגרת’, ‘ מהירות’ ו’חישוב ממוצע של ערכי מספר ‘ .הערה: ההגדרות האופייניות לניסויים אלה מסומנות בקובץ משלים 1A. הפחתת הזום תחת אזור הסריקה כותרת בתוך הכרטיסיה רכישה יכולה להגדיל את שדה התצוגה מבלי לשנות את הזמן הדרוש לרכישת תמונה. בכרטיסיה רכישה , תחת הכותרת רכישה ממדית , לחץ על תיבת השנתות Z-מחסנית . פתח את הכרטיסיה ‘ מחסנית z ‘ כדי להגדיר את המרווח בין תמונות בכיוון Z עד 2.5 μm. כדי להגדיר את המיקומים הנכונים, בחר רק את RFP/T-PMT בכרטיסיה ערוצים ולחץ על Live כדי להמחיש את המשובטים האדומות עם חלוקה לעין של הרקמה. הגדר את הפרוסה הראשונה והאחרונה על-ידי לחיצה על הגדר first והגדר האחרונה בפרוסה המתאימה, כוונון המוקד באמצעות כפתור המיקרוסקופ. לחץ על הכרטיסיה סרוק את המשבצת בתוך הכרטיסיה רכישה והזן את המספר הכולל של האריחים בכיוונים האופקיים והאנכיים בתיבות המתאימות. עבור לכידת תמונה, בחר את כל הערוצים הרצויים בכרטיסיה ערוצים ולאחר מכן לחץ על לחצן הצמד כדי לאסוף תמונה בודדת, או על הלחצן התחל ניסוי כדי לאסוף סריקת מחסנית/אריח Z. לאחר שהתמונה נרכשה, לחץ על קובץ ולאחר מכן שמור בשם ושמור את התמונה בסוג קובץ השומר על הגדרות המיקרוסקופ ככל האפשר, כדי לאפשר סקירה מאוחרת יותר ושימוש חוזר. בצע ניתוח נוסף באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.