Klonale genetische tracing met de confetti muis om gemineraliseerde weefsels te bestuderen
Summary
Deze methode beschrijft het gebruik van het R26R-Confetti (Confetti) muismodel om gemineraliseerde weefsels te bestuderen, die alle stappen van de fokstrategie naar het beeld acquirements bedekken. Inbegrepen is een algemeen protocol dat kan worden toegepast op alle zachte weefsels en een gemodificeerd protocol dat kan worden toegepast op gemineraliseerde weefsels.
Abstract
Het labelen van een individuele cel in het lichaam om te controleren welke celtypen kan leiden tot en het bijhouden van de migratie door het organisme of bepalen de levensduur kan een krachtige manier om te onthullen mechanismen van weefsel ontwikkeling en onderhoud. Een van de belangrijkste tools die momenteel beschikbaar zijn voor het bewaken van cellen in vivo is het confetti muismodel. Het confetti model kan worden gebruikt voor het genetisch labelen van individuele cellen in levende muizen met verschillende fluorescerende eiwitten in een celtypespecifieke manier en het volgen van hun lot, evenals het lot van hun nakomelingen in de loop van de tijd, in een proces genaamd van klonen genetische tracing of klonale Lineage tracing. Dit model werd bijna een decennium geleden gegenereerd en heeft bijgedragen aan een beter begrip van veel biologische processen, met name in verband met stamcel biologie, ontwikkeling en vernieuwing van volwassen weefsels. Echter, behoud van het fluorescerende signaal tot het verzamelen van beelden en gelijktijdige opname van verschillende fluorescerende signalen is technisch uitdagend, met name voor gemineraliseerd weefsel. In deze publicatie wordt een stapsgewijs protocol beschreven voor het gebruik van het confetti model om de groei plaat kraakbeen te analyseren die kan worden toegepast op alle gemineraliseerde of niet-gemineraliseerde weefsels.
Introduction
Verbeterde methoden om het gedrag van cellen te bewaken, zijn wenselijk om de experimentele efficiëntie te verhogen bij het gebruik van diermodellen. Een van de meest informatieve benaderingen voor het bewaken van Celgedrag in vivo is van klonen Lineage tracing met multicolor reporter muis stammen1, met inbegrip van de veelgebruikte R26R-Confetti (Confetti) muis2. Door het genetisch labelen van individuele cellen met fluorescerende eiwitten en het volgen van die cellen in de loop van de tijd, hebben onderzoekers op veel gebieden de confetti muis gebruikt om inzichten te onthullen in een veelheid van verschillende biologische systemen.
De confetti muis is een loxP-based reporter systeem waarin CRE afhankelijke DNA recombinatie de permanente expressie van een van de verschillende mogelijke fluorescerende eiwitten op een stochastische manier2veroorzaakt. De R26R-confetti allel bevat de alomtegenwoordige CAGG Promoter, die direct stroomopwaarts ligt van een loxP-geflankeerd NeoR-cassette2, waarvan de polyadenylatie sequentie de transcriptie3beëindigt, gevolgd door de Brainbow 2,1 construct4. Vandaar dat CRE-gemedieerde recombinatie tegelijkertijd de neoR-cassette uitblinkte en leidt tot de productie van bepaalde fluorescerende eiwitten, afhankelijk van welke delen van de brainbow 2,1 constructie zijn weggesneden. Deze functie maakt de confetti muis uiterst aanpasbaar, omdat deze kan worden gebruikt om elke cellulaire populatie in een muis te targeten waarvoor een specifieke CRE-stam beschikbaar is. De kruising van een weefsel-specifieke CRE stam met de R26R-confetti stam biedt de specificiteit van labeling. De belasting van de CRE moet echter ook noodzakelijk zijn (bijv. CreERT of CreERT2, die Tamoxifen binding nodig heeft om hen in staat te stellen de Nucleus binnen te komen en DNA recombinatie5te induceren), zodat het labelen op bepaalde tijdstippen kan worden bereikt. Zo kan een cellulaire populatie worden gelabeld door het injecteren van de resulterende CreERT-positieve/confetti-positieve nakomelingen met tamoxifen op het gewenste tijdstip en getraceerd tot een bepaalde leeftijd, wanneer de weefsels van belang kunnen worden verzameld voor analyse. Na weefsel verwerking kunnen de fluorescerende gelabelde cellen direct worden gevisualiseerd door confocale microscopie, zodat de nakomelingen van elke aanvankelijk gelabelde cel kunnen worden gescheiden van de nakomelingen die worden gegenereerd door een andere gelabelde cel op basis van hun specifieke fluorescerende van de etiketten, waardoor clonaliteit kan worden beoordeeld (d.w.z. een klonale genetische tracering).
Door de flexibiliteit van het confetti model is het toegepast om de ontwikkeling en het onderhoud van veel verschillende weefsels in gezondheid en ziekte2,6,7,8,9, 10,11. Een veelgebruikte manier om het model te gebruiken is om een bepaalde populatie cellen te labelen en te bepalen in welke weefsels zij (en/of hun nakomelingen) hebben bijgedragen. Een dergelijke bevinding met behulp van deze aanpak was dat de volwassen tand bestaat uit cellen met een gliale oorsprong6. Een andere toepassing van het model is het bestuderen van stamcel homeostase. Bijvoorbeeld, het confetti model onthulde dat stamcel niches in de intestinale crypten geleidelijk monoklonaal worden, omdat sommige stamcel klonen dominant zijn tijdens de competitie tussen stamcellen2. Het model kan ook worden gebruikt om celproliferatie te beoordelen, wat vooral nuttig is voor het bestuderen van langzaam cellen verdelen. Bijvoorbeeld, klonale vorming in het articulaire kraakbeen12 werd beoordeeld, en de korte-termijn effecten van een egel-antagonist op groei plaat chondrocyten in vijf weken oude muizen werd bestudeerd13.
Ondanks de relatieve eenvoud van het confetti model, kan het fluorescerende signaal technisch uitdagend zijn om te behouden tot de beeld verzameling, vooral bij het analyseren van gemineraliseerde weefsels. Hier beschrijft het protocol een geoptimaliseerd model om de confetti muis te gebruiken met het postnatale bot (tot 6 maanden oud), waardoor fluorescerende eiwitten direct gevisualiseerd kunnen worden door confocale microscopie zonder dat er immunodetectie nodig is. Dit vereenvoudigde protocol kan worden toegepast op niet-gemineraliseerde weefsels. Bovendien is inbegrepen een beschrijving van het opslaan van de monsters om het fluorescerende signaal gedurende een langere periode van ten minste 3 jaar te bewaren. Een overzicht van het protocol wordt weergegeven in Figuur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het confetti model werd veelvuldig gebruikt om de gemineraliseerde kraakbeen weefsels12,13en14 te bestuderen en om het geoptimaliseerde protocol te beschrijven. Confetti muizen2 met één exemplaar of twee exemplaren van de R26R-confetti allel kunnen worden gebruikt voor de fokkerij en experimenten. Recombinatie in muizen met één allel van de Brainbow 2,1 construct zal geven vier potentiële Labels: rood fluorescerende eiwit (RFP, Cytoplasmic), geel fluorescerende eiwit (YFP, Cytoplasmic), cyaan fluorescerende eiwit (GVB, membraan-gelokaliseerd), en groen fluorescerende proteïne (GFP, Nucleus-gelokaliseerd), terwijl recombinatie in de homozygoot confetti muizen (d.w.z. met twee kopieën van de Brainbow 2,1 construct) 10 mogelijke kleur uitgangen geven (RFP + RFP, RFP + YFP, RFP + CFP, RFP + GFP, YFP + YFP, YFP + GVB, YFP + GFP, GVB + GVB, GVB + GFP, GFP + GFP). Echter, omdat de DNA-excisie en inversie gebeurtenissen op een stochastische manier optreden, recombinatie voor de productie van GFP treedt op in slechts een kleine fractie van cellen, zoals eerder gerapporteerd2, en schijnbaar verschilt per cel-type of CRE lijn gebruikt2, 12,13. Daarom zijn zes kleur uitgangen de meest voorkomende bij homozygoot confetti muizen, gezien het lage optreden van recombinatie gebeurtenissen die tot de GFP-uitdrukking leiden.
Een belangrijke overweging bij het plannen van experimenten met de confetti muis is het vinden van een geschikte CRE stam. Ten eerste, omdat de confetti allel verschillende loxP-sites heeft, sluit één recombinatie gebeurtenis een tweede4niet uit. Dit betekent dat als een cel wordt gelabeld en verdeelt om een kloon van één kleur te produceren, een tweede recombinatie gebeurtenis in een van de dochtercellen een andere kleur genereert, waardoor de echte van klonen-uitbreiding wordt maskeert. Dus, niet-indugbaar CRE stammen, waar het enzym is altijd actief als de bijbehorende promotor actief is, zijn niet aan te raden. Ten tweede komt in sommige stammen de uitdrukking van CRE of vaak ten koste van een endogeen eiwit, waardoor een fenotype van zichzelf ontstaat (bv. voor de Prg4-GFPCreERT2 klop-in muis stam waarbij muizen twee CRE-allelen15), een enkel exemplaar van het CRE-allel is dus wenselijk. In alle beschreven experimenten, een enkel exemplaar van de Col2CreERT16 werd gedragen door ofwel de mannelijke of de vrouwelijke ouder om Col2CreERT te genereren: confetti muizen, zoals beschreven13. Vervolgens is de specificiteit van de CRE-lijn naar het celtype van belang een belangrijke overweging. Bijvoorbeeld, Col2CreERT is Chondrocyte-specifieke, maar labels verschillende populaties van chondrocyten in vroege postnatale kraakbeen17. Ten slotte kan de activiteit van verschillende CRE-stammen aanzienlijk veranderen met de dieren tijd, omdat de endogene activiteit van de organisator wordt gebruikt voor CRE-expressie wijzigingen, zelfs in cellen van hetzelfde type (bijvoorbeeld Prg4-GFPCreERT2, die een toenemende aantal doses Tamoxifen om oppervlakkige zone cellen te labelen als muizen leeftijd15).
Het aantal gelabelde cellen zal worden weerspiegeld door de hoeveelheid Tamoxifen gegeven, dus het is niet altijd wenselijk om de maximale dosis te geven, omdat het onderscheiden van klonen van elkaar moeilijk kan zijn. Omdat CRE uitdrukking zal variëren onder de regulering van verschillende promotors en met de leeftijd, de Tamoxifen dosering zal moeten worden aangepast aan het optimaliseren van de labeling. Het is belangrijk op te merken dat cellen niet onmiddellijk worden fluorescerend bij het triggeren van recombinatie, omdat de tijd nodig is om de recombinatie te laten plaatsvinden en de resulterende fluorescerende eiwitten voldoende accumuleren voorbeeld vorming. Een breed scala aan uren (tussen 24 − 72 uur) is nodig, die lijkt te worden beïnvloed door de CRE-lijn, het celtype en de dier leeftijd. Aangezien Tamoxifen biologisch actief kan zijn lang na toediening18 is het altijd raadzaam om de recombinatie-efficiëntie in elk model grondig te controleren.
Tijdens de confocale microscopie stap, excitatie van de confetti fluorescerende eiwitten vereist penetratie van het weefsel door laserlicht. Omdat verschillende weefsels verschillende eigenschappen hebben, laserlicht kan niet doordringen 160 μm dikke delen van alle weefsels. Echter, dergelijke dikke secties kunnen worden gebruikt voor groei plaat kraakbeen, zoals gebruikt in Figuur 2, Figuur 3. Merk op dat elke Microscoop anders is, en het is onwaarschijnlijk dat de beschreven instellingen (aanvullend bestand 1) perfect zullen werken zonder kleine aanpassingen. Een van de grootste uitdagingen is het onderscheiden van de verschillende fluorescerende eiwitten om ervoor te zorgen dat er geen verontreiniging van het ene kanaal naar het andere is. Bijvoorbeeld, het signaal in de YFP kanaal veroorzaakt door de fluorescentie afkomstig van GFP overlappingen tussen de YFP en RFP kanalen. YFP-en CFP-kanalen moeten ook zorgvuldig worden gecontroleerd. Dit kan op verschillende manieren gebeuren. Ten eerste kan het emissie bereik van tl-licht golflengten die voor elk fluorescerende eiwit worden opgenomen, worden verkleind. Ten tweede kan het aanpassen van het Laser vermogen in combinatie met de digitale versterking het signaal optimaliseren. In deze studie waren deze stappen voldoende, maar ze vertrouwen op een sterk fluorescerende signaal. Dit betekent dat in theorie, inefficiënte weefsel verwerking de activiteit van de fluorescerende eiwitten kan verminderen, of een zwakke laserlichtbron kan de scheiding van het kanaal belemmeren.
Een van de voordelen van de confetti muis is dat het kan worden gecombineerd met een groot aantal genetisch gemuteerde stammen die beschikbaar zijn, zodat de impact van specifieke genen op de klonale dynamiek kan worden bestudeerd10,11,12 ,13,14,19,20, zij het met enkele beperkingen. Bijvoorbeeld, recombinatie van de confetti allelen en het gen van belang kan niet worden gescheiden bij het gebruik van CRE loxp-gebaseerde mutanten gecombineerd met van klonen Lineage tracing. Niettemin, dergelijke samenvalt recombinatie gebeurtenissen kunnen effectief zijn10,14,20. Deze mogelijkheid werd bijvoorbeeld gebruikt om het toegenomen aantal cellen in de rustzone van muizen te onderzoeken na de postnatale Chondrocyte-specifieke ablatie van TSC1 in de groei plaat21 en onthulde de klonale relatie tussen deze cel na verloop van tijd 13. Daarnaast kan de Weefselspecifieke klonale analyse met confetti muizen worden gebruikt met niet-CRE loxp-gebaseerde Mutante muizen11, en het is ook mogelijk om deze benaderingen te combineren met farmacologische8,9 ,13 en/of chirurgische modellen8 om klonale reacties op andere functionele verstoringen te visualiseren. Verdere kansen ontstaan bij het combineren van confetti gelabelde secties met immunodetectie van endogene eiwitten door immunofluorescentie. Een dergelijke analyse maakt de identificatie mogelijk van getraceerde cellen en hun colokalisatie met een bekende marker. Met de hierin beschreven fixatie methode is het mogelijk immunofluorescentie uit te voeren en de fluorescentie van de confetti fluorescerende eiwitten12,13nog steeds te visualiseren. In de genoemde documenten was geen antigeen-opvraging echter niet vereist. Harde antigeen retrieval methoden, zoals koken in citraat buffer, leidt tot een volledig verlies van confetti fluorescentie. Hoewel de confetti fluorescerende eiwitten vervolgens kunnen worden gedetecteerd met behulp van antilichamen22, kan een verlies van klonale identiteit optreden.
Samengevat is het gebruik van het confetti model om cellen in vivo te labelen een informatief hulpmiddel om het lot van die cellen in de loop van de tijd te analyseren. De beschreven methode biedt een snelle en efficiënte manier om de fluorescerende eiwit expressie in gemineraliseerde weefsels direct te visualiseren.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Evgeny Ivashkin voor methodologisch advies. Dit werk werd financieel gesteund door de Zweedse Onderzoeksraad (A. S. C), de Russische wetenschappelijke Stichting (Grant #19-15-00241 tot ASC), Karolinska Institute (A.S.C.), StratRegen KI en Stiftelsen Konung Gustaf V:s 80-årsfond (A.S.C.), Stiftelsen Frimurare barnhuset en Sallskapet Barnavard (P.T.N.), Chinese beurs Raad (B.Z. Group). De confocale Microscoop werd gefinancierd door de Knut en de Alice Wallenberg Foundation.
Materials
| 2,2-thiodiethanol | Sigma | MKCF9328 | |
| 60 mm-long cover slips | Mendel-Gläzer | 220588 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | |
| Cryomold (standard) | Sakura | 4557 | |
| Cryostat | Thermo | Model: NX70 | |
| Disposable cryostat blades | Histolab | 207500014 | Specifically for use with hard tissue |
| EDTA | Scharlan | AC0960005P | |
| Formaldehyde concentrate | Merck | 8.18708.1000 | |
| Glass bottles | Sigma | V7130 | Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing |
| Imaris software | Oxford Instruments | N/A | Image analysis software for 3D reconstruction |
| Isoflurane | Zoetis | 11-8162 | |
| OCT | Sakura | 102094-104 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| PBS | Gibco | 14200075 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1.06498.1000 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost UltraPlus slides | Mendel-Gläzer | J3800AMNZ | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Zen2 software | Zeiss | N/A | Freeware for Confocal laser scanning microscopy |
References
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Proudfoot, N. J. Ending the message: poly(A) signals then and now. Genes & Development. 25 (17), 1770-1782 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Füllgrabe, A., et al. Dynamics of Lgr6+ Progenitor Cells in the Hair Follicle, Sebaceous Gland, and Interfollicular Epidermis. Stem Cell Reports. 5 (5), 843-855 (2015).
- Lazzeri, E., et al. Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury. Nature Communications. 9 (1), 1344 (2018).
- Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
- Yoo, Y. A., et al. The Role of Castration-Resistant Bmi1+Sox2+ Cells in Driving Recurrence in Prostate Cancer. Journal of the National Cancer Institute. 111 (3), 311-321 (2018).
- McConnell, A. M., et al. p53 Regulates Progenitor Cell Quiescence and Differentiation in the Airway. Cell Reports. 17 (9), 2173-2182 (2016).
- Li, L., et al. Superficial cells are self-renewing chondrocyte progenitors, which form the articular cartilage in juvenile mice. Faseb Journal. 31 (3), 1067-1084 (2017).
- Newton, P. T., et al. A radical switch in clonality reveals a stem cell niche in the epiphyseal growth plate. Nature. 567 (7747), 234-238 (2019).
- Kaucka, M., et al. Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage. eLife. 6, 25902 (2017).
- Kozhemyakina, E., et al. Identification of a Prg4-expressing articular cartilage progenitor cell population in mice. Arthritis Rheumatology. 67 (5), 1261-1273 (2015).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreERT to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Developmental Dynamics. 235 (9), 2603-2612 (2006).
- Mizuhashi, K., et al. Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells. Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).
- Reinert, R. B., et al. Tamoxifen-Induced Cre loxP Recombination Is Prolonged in Pancreatic Islets of Adult Mice. PloS One. 7 (3), 33529 (2012).
- Kim, I. S., et al. In vitro response of primary human bone marrow stromal cells to recombinant human bone morphogenic protein-2 in the early and late stages of osteoblast differentiation. Development, Growth & Differentiation. 50 (7), 553-564 (2008).
- Fang, X., Gyabaah, K., Nickkholgh, B., Cline, J. M., Balaji, K. C. Novel In Vivo model for combinatorial fluorescence labeling in mouse prostate. The Prostate. 75 (9), 988-1000 (2015).
- Newton, P. T., Xie, M., Medvedeva, E. V., Sävendahl, L., Chagin, A. S. Activation of mTORC1 in chondrocytes does not affect proliferation or differentiation, but causes the resting zone of the growth plate to become disordered. Bone Reports. 8, 64-71 (2018).
- Xie, M., et al. Schwann cell precursors contribute to skeletal formation during embryonic development in mice and zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (30), 15068-15073 (2019).
