Clonale genetische Tracing mit der Konfetti-Maus zur Untersuchung mineralisierter Gewebe
Summary
Diese Methode beschreibt die Verwendung des R26R-Konfetti (Konfetti) Mausmodells zur Untersuchung mineralisierter Gewebe, die alle Schritte von der Zuchtstrategie bis zu den Bilderfassungen abdeckt. Enthalten ist ein allgemeines Protokoll, das auf alle Weichgewebe angewendet werden kann, und ein modifiziertes Protokoll, das auf mineralisierte Gewebe angewendet werden kann.
Abstract
Eine einzelne Zelle im Körper zu beschriften, um zu überwachen, welche Zelltypen sie hervorrufen kann, und ihre Migration durch den Organismus zu verfolgen oder ihre Langlebigkeit zu bestimmen, kann eine leistungsfähige Möglichkeit sein, Mechanismen der Gewebeentwicklung und -erhaltung aufzudecken. Eines der wichtigsten Derzeit verfügbaren Werkzeuge zur Überwachung von Zellen in vivo ist das Konfetti-Mausmodell. Das Konfetti-Modell kann verwendet werden, um einzelne Zellen bei lebenden Mäusen mit verschiedenen fluoreszierenden Proteinen zelltypspezifisch genetisch zu kennzeichnen und ihr Schicksal sowie das Schicksal ihrer Nachkommen im Laufe der Zeit zu überwachen, in einem Prozess, der als klonale genetische Tracing oder klonale Linienverfolgung. Dieses Modell wurde vor fast einem Jahrzehnt erstellt und hat zu einem besseren Verständnis vieler biologischer Prozesse beigetragen, insbesondere im Zusammenhang mit der Stammzellbiologie, der Entwicklung und der Erneuerung von erwachsenen Geweben. Die Erhaltung des fluoreszierenden Signals bis zur Bildaufnahme und gleichzeitigen Erfassung verschiedener fluoreszierender Signale ist jedoch technisch eine Herausforderung, insbesondere für mineralisiertes Gewebe. Diese Publikation beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Verwendung des Konfetti-Modells zur Analyse des Wachstumsplattenknorpels, der auf jedes mineralisierte oder nichtmineralisierte Gewebe aufgebracht werden kann.
Introduction
Verbesserte Methoden zur Überwachung des Zellverhaltens sind wünschenswert, um die experimentelle Effizienz bei der Verwendung von Tiermodellen zu erhöhen. Einer der informativsten Ansätze zur Überwachung des Zellverhaltens in vivo ist die klonale Linienverfolgung mit mehrfarbigen Reporter-Mausstämmen1, einschließlich der weit verbreiteten R26R-Konfetti (Confetti) Maus2. Durch die genetische Kennzeichnung einzelner Zellen mit fluoreszierenden Proteinen und die Verfolgung dieser Zellen im Laufe der Zeit haben Forscher in vielen Bereichen die Konfetti-Maus verwendet, um Einblicke in eine Vielzahl verschiedener biologischer Systeme zu gewinnen.
Die Konfetti-Maus ist ein loxP-basiertes Reportersystem, bei dem eine creabhängige DNA-Rekombination die permanente Expression eines von mehreren möglichen fluoreszierenden Proteinen in stochastischer Weise verursacht2. Das R26R-Konfetti-Allel enthält den allgegenwärtig ausgedrückten CAGG-Promotor, der unmittelbar vor einer loxP-flankierten NeoR-Kassette2liegt, deren Polyadenylierungssequenz die Transkription3beendet, gefolgt von der Brainbow 2.1 Konstrukt4. Daher wird die NeoR-Kassettedurch cre-vermittelte Rekombinationen gleichzeitig ausgeschnitten und führt zur Produktion bestimmter fluoreszierender Proteine, je nachdem, welche Teile des Brainbow 2.1-Konstrukts verbrauchen. Diese Funktion macht die Konfetti-Maus extrem anpassungsfähig, da sie verwendet werden kann, um jede zelluläre Population in einer Maus anzusprechen, für die ein bestimmter Cre-Stamm verfügbar ist. Die Überquerung eines gewebespezifischen Cre-Stamms mit dem R26R-Konfetti-Stamm sorgt für die Spezifität der Etikettierung. Der Cre-Stamm sollte jedoch auch induzierbar sein (z. B. CreERT oder CreERT2, die eine Tamoxifenbindung erfordern, damit sie in den Zellkern gelangen und eine DNA-Rekombination induzieren5), so dass die Kennzeichnung zu bestimmten Zeitpunkten erreicht werden kann. So kann eine zelluläre Population durch Injektion des resultierenden CreERT-positiven/Konfetti-positiven Nachwuchses mit Tamoxifen zum gewünschten Zeitpunkt markiert und bis zu einem bestimmten Alter verfolgt werden, wenn die gewebe von Interesse zur Analyse gesammelt werden können. Nach der Gewebeverarbeitung können die fluoreszierend gekennzeichneten Zellen direkt durch konfokale Mikroskopie visualisiert werden, so dass die Nachkommen jeder ursprünglich beschrifteten Zelle von der Nachkommenschaft getrennt werden können, die von jeder anderen markierten Zelle auf der Grundlage ihrer spezifischen fluoreszierenden klonalen genetischen Spuren) zu ermöglichen, wodurch die Klonalität beurteilt werden kann.
Aufgrund der Flexibilität des Konfetti-Modells wurde es angewendet, um die Entwicklung und Wartung vieler verschiedener Gewebe in Gesundheit und Krankheit zu studieren2,6,7,8,9, 10,11. Eine gängige Möglichkeit, das Modell zu verwenden, besteht darin, eine bestimmte Population von Zellen zu kennzeichnen und zu bestimmen, zu welchem Gewebe sie (und/oder ihre Nachkommen) beigetragen haben. Ein solcher Befund mit diesem Ansatz war, dass der erwachsene Zahn aus Zellen mit einem gliaalen Ursprungbesteht 6. Eine weitere Anwendung des Modells ist die Untersuchung der Stammzellhomöostase. Zum Beispiel zeigte das Konfetti-Modell, dass Stammzellnischen in den Darmkrypten allmählich monoklonal werden, weil einige Stammzellklone im Wettbewerb zwischen Stammzellen2dominant sind. Das Modell kann auch verwendet werden, um die Zellproliferation zu bewerten, was besonders nützlich für die Untersuchung langsam teilender Zellen ist. Zum Beispiel wurde die klonale Bildung im Gelenkknorpel12 untersucht, und die kurzfristigen Auswirkungen eines Igelantagonisten auf Wachstumsplattenchondrozyten bei fünf Wochen alten Mäusen wurden untersucht13.
Trotz der relativen Einfachheit des Konfetti-Modells kann das fluoreszierende Signal technisch schwierig sein, bis zur Bildsammlung zu erhalten, insbesondere bei der Analyse mineralisierter Gewebe. Hier beschreibt das Protokoll ein optimiertes Modell zur Verwendung der Konfettimaus mit dem postnatalen Knochen (bis zu 6 Monaten), so dass fluoreszierende Proteine direkt durch konfokale Mikroskopie visualisiert werden können, ohne dass eine Immundetektion erforderlich ist. Dieses vereinfachte Protokoll kann auf nichtmineralisierte Gewebe angewendet werden. Darüber hinaus enthält eine Beschreibung, wie die Proben zu speichern, um das Fluoreszenzsignal für einen längeren Zeitraum von mindestens 3 Jahren zu erhalten. Eine Übersicht des Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Konfetti-Modell wurde ausgiebig verwendet, um mineralisierte Knorpelgewebe12,13,14 zu untersuchen und das optimierte Protokoll zu beschreiben. Konfettimäuse2 mit einer oder zwei Kopien des R26R-Konfetti-Alleels können für Zucht und Experimente verwendet werden. Die Rekombination bei Mäusen mit einem Allel des Brainbow 2.1-Konstrukts gibt vier potenzielle Bezeichnungen: rotes fluoreszierendes Protein (RFP, zytoplasmatisch), gelbes fluoreszierendes Protein (YFP, zytoplasmatisch), Cyan-Fluoreszenzprotein (CFP, membranlokalisiert) und grün fluoreszierendes Protein (GFP, Nucleus-lokalisiert), während die Rekombination in den homozygoten Konfetti-Mäusen (d.h. zwei Kopien des Brainbow 2.1-Konstrukts) 10 mögliche Farbausgänge (RFP+RFP, RFP+YFP, RFP+GFP, RFP+GFP, YFP+YFP, YFP+CFP, YFP+ GFP, GFP+CFP, GFP+GFP, GFP+GFP). Da die DNA-Exzisions- und Inversionsereignisse jedoch stochastisch auftreten, tritt die Rekombination zur Erzeugung von GFP nur in einem kleinen Bruchteil der Zellen auf, wie zuvor berichtet2, und unterscheidet sich scheinbar nach Zelltyp oder Cre-Linie,die verwendetwird 2, 12,13. Angesichts des geringen Auftretens von Rekombinationsereignissen, die zum GFP-Ausdruck führen, sind daher sechs Farbausgänge die häufigsten bei homozygoten Konfetti-Mäusen.
Ein wichtiger Aspekt bei der Planung von Experimenten mit der Konfettimaus ist die Suche nach einem geeigneten Cre-Stamm. Erstens, da das Konfetti-Allel mehrere loxP-Sites hat, schließt ein Rekombinationsereignis ein zweites4nicht aus. Dies bedeutet, dass, wenn eine Zelle beschriftet ist und sich teilt, um einen Klon einer Farbe zu erzeugen, ein zweites Rekombinationsereignis in einer seiner Tochterzellen eine andere Farbe erzeugen würde, wodurch die wahre klonale Expansion maskiert würde. Daher sind nicht induzierbare Cre-Stämme, bei denen das Enzym immer aktiv ist, wenn der entsprechende Promotor aktiv ist, nicht ratsam. Zweitens geht die Expression der Cre-Recombinase bei einigen Stämmen oft auf Kosten eines endogene Proteins, wodurch ein eigener Phänotyp entsteht (z. B. für den Prg4-GFPCreERT2-Knock-in-Mausstamm, bei dem Mäuse zwei Cre-Allele beherbergen15), daher ist eine einzige Kopie des Cre-Alleels wünschenswert. In allen beschriebenen Experimenten wurde eine einzige Kopie des Col2CreERT16 entweder vom männlichen oder vom weiblichen Elternteil getragen, um Col2CreERT:Konfetti-Mäuse zu erzeugen, wiebeschrieben 13. Als nächstes ist die Spezifität der Cre-Linie für den Zelltyp des Interesses eine wichtige Überlegung. Zum Beispiel ist Col2CreERT chondrocyt-spezifisch, aber kennzeichnet mehrere verschiedene Populationen von Chondrozyten im frühen postnatalen Knorpel17. Schließlich kann sich die Aktivität verschiedener Cre-Stämme mit dem Alter der Tiere erheblich ändern, da sich die endogene Aktivität des für cre-Expression genutzten Promotors ändert, selbst in Zellen desselben Typs (z. B. Prg4-GFPCreERT2, die eine Erhöhung der Anzahl der Tamoxifen-Dosen zur Kennzeichnung oberflächlicher Zonenzellen als Mäuse im Alter von15Jahren ).
Die Anzahl der markierten Zellen wird durch die Menge an Tamoxifen angegeben, so ist es nicht immer wünschenswert, die maximale Dosis zu geben, weil die Unterscheidung klonen voneinander schwierig sein kann. Da Cre Ausdruck unter der Regulierung der verschiedenen Promotoren sowie mit dem Alter variieren, muss die Tamoxifen-Dosierung angepasst werden, um die Etikettierung zu optimieren. Es ist wichtig zu beachten, dass Zellen bei der Auslösen der Rekombination nicht sofort fluoreszierend sind, da Zeit benötigt wird, damit die Rekombination auftritt und sich die resultierenden fluoreszierenden Proteine ausreichend für die Bildgebung ansammeln. Es wird ein breites Stundenspektrum (zwischen 24 und 72 h) benötigt, das durch die Cre-Linie, den Zelltyp und das Alter der Tiere beeinflusst zu sein scheint. Da Tamoxifen lange nach Verabreichung18 biologisch aktiv sein kann, ist es immer ratsam, die Rekombinationseffizienz in jedem Modell gründlich zu überprüfen.
Während des konfokalen Mikroskopieschritts erfordert die Anregung der Konfetti-Fluoreszenzproteine das Eindringen des Gewebes durch Laserlicht. Da verschiedene Gewebe unterschiedliche Eigenschaften haben, kann Laserlicht nicht 160 ‘m dicke Abschnitte aller Gewebe durchdringen. Solche dicken Abschnitte können jedoch für Wachstumsplattenknorpel verwendet werden, wie in Abbildung 2, Abbildung 3verwendet. Beachten Sie, dass jedes Mikroskop anders ist, und es ist unwahrscheinlich, dass die beschriebenen Einstellungen (Ergänzende Datei 1) ohne geringfügige Anpassungen perfekt funktionieren. Eine der größten Herausforderungen besteht darin, die verschiedenen fluoreszierenden Proteine zu unterscheiden, um sicherzustellen, dass es keine Kontamination von einem Kanal zum anderen gibt. Beispielsweise überschneidet sich das Signal im YFP-Kanal, das durch die Fluoreszenz von GFP verursacht wird, zwischen den YFP- und RFP-Kanälen. YFP- und GFP-Kanäle müssen ebenfalls sorgfältig geprüft werden. Dies kann auf verschiedene Weise erfolgen. Zunächst kann der Emissionsbereich von fluoreszierenden Lichtwellenlängen, die für jedes fluoreszierende Protein aufgezeichnet werden, verengt werden. Zweitens kann die Einstellung der Laserleistung in Kombination mit der digitalen Verstärkung das Signal optimieren. In dieser Studie waren diese Schritte ausreichend, aber sie verlassen sich auf ein starkes fluoreszierendes Signal. Dies bedeutet, dass theoretisch eine ineffiziente Gewebeverarbeitung die Aktivität der fluoreszierenden Proteine reduzieren kann oder eine schwache Laserlichtquelle die Kanaltrennung beeinträchtigen kann.
Einer der Vorteile der Konfetti-Maus ist, dass sie mit einer großen Anzahl von genetisch mutierten Stämmen kombiniert werden kann, die verfügbar sind, so dass der Einfluss bestimmter Gene auf die klonale Dynamik untersucht werden kann10,11,12 ,13,14,19,20, wenn auch mit einigen Einschränkungen. Beispielsweise kann die Rekombination der Konfetti-Allele und des Gens von Interesse nicht getrennt werden, wenn Cre loxP-basierte Mutanten in Kombination mit klonaler Linienverfolgung verwendet werden. Dennoch können solche gleichzeitigen Rekombinationsereignisse wirksam sein10,14,20. Zum Beispiel wurde diese Möglichkeit genutzt, um die erhöhte Zellzahl in der Ruhezone von Mäusen nach postnataler Chondrozyten-spezifischer Ablation von TSC1 in der Wachstumsplatte21 zu untersuchen und die klonale Beziehung zwischen diesen Zellen im Laufe der Zeit zu zeigen. 13. Zusätzlich kann die gewebespezifische klonale Analyse mit Konfetti-Mäusen mit nicht-Cre LoxP-basierten Mutantenmäusen11verwendet werden, und es ist auch möglich, diese Ansätze mit pharmakologischen8,9 ,13 und/oder chirurgische Modelle8, um klonale Reaktionen auf andere funktionelle Störungen zu visualisieren. Weitere Chancen ergeben sich bei der Kombination von Konfetti-gekennzeichneten Abschnitten mit immunemditionium endogene Proteine durch Immunfluoreszenz. Eine solche Analyse ermöglicht die Identifizierung von verfolgten Zellen und deren Kolokalisierung mit einem bekannten Marker. Mit der hier beschriebenen Fixierungsmethode ist es möglich, Immunfluoreszenz zu leiten und dennoch die Fluoreszenz der Konfettifluoreszenzproteine12,13zu visualisieren. In den genannten Papieren war jedoch keine Antigenrückgewinnung erforderlich. Harte Antigen-Retrieval-Methoden, wie das Kochen im Citratpuffer, führt zu einem vollständigen Verlust der Konfettifluoreszenz. Obwohl die Konfetti-Fluoreszenzproteine dann mit Antikörpern22nachgewiesen werden können, kann ein Verlust der klonalen Identität auftreten.
Zusammenfassend ist die Verwendung des Konfetti-Modells zur Kennzeichnung von Zellen in vivo ein informatives Werkzeug, um das Schicksal dieser Zellen im Laufe der Zeit zu analysieren. Die beschriebene Methode bietet eine schnelle und effiziente Möglichkeit, die fluoreszierende Proteinexpression in mineralisierten Geweben direkt zu visualisieren.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Evgeny Ivashkin für die methodische Beratung. Diese Arbeit wurde vom Swedish Research Council (A.S.C),The Russian Scientific Foundation (Grant #19-15-00241 an ASC), Karolinska Institute (A.S.C.), StratRegen KI und Stiftelsen Konung Gustaf V:s 80-srsfond (A.S.C.), Stiftelsen, finanziell unterstützt. Frimurare Barnhuset und Sallskapet Barnavard (P.T.N.), Chinese Scholarship Council (B.Z.). Das konfokale Mikroskop wurde von der Knut and Alice Wallenberg Foundation finanziert.
Materials
| 2,2-thiodiethanol | Sigma | MKCF9328 | |
| 60 mm-long cover slips | Mendel-Gläzer | 220588 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | |
| Cryomold (standard) | Sakura | 4557 | |
| Cryostat | Thermo | Model: NX70 | |
| Disposable cryostat blades | Histolab | 207500014 | Specifically for use with hard tissue |
| EDTA | Scharlan | AC0960005P | |
| Formaldehyde concentrate | Merck | 8.18708.1000 | |
| Glass bottles | Sigma | V7130 | Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing |
| Imaris software | Oxford Instruments | N/A | Image analysis software for 3D reconstruction |
| Isoflurane | Zoetis | 11-8162 | |
| OCT | Sakura | 102094-104 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| PBS | Gibco | 14200075 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1.06498.1000 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost UltraPlus slides | Mendel-Gläzer | J3800AMNZ | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Zen2 software | Zeiss | N/A | Freeware for Confocal laser scanning microscopy |
References
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Proudfoot, N. J. Ending the message: poly(A) signals then and now. Genes & Development. 25 (17), 1770-1782 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Füllgrabe, A., et al. Dynamics of Lgr6+ Progenitor Cells in the Hair Follicle, Sebaceous Gland, and Interfollicular Epidermis. Stem Cell Reports. 5 (5), 843-855 (2015).
- Lazzeri, E., et al. Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury. Nature Communications. 9 (1), 1344 (2018).
- Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
- Yoo, Y. A., et al. The Role of Castration-Resistant Bmi1+Sox2+ Cells in Driving Recurrence in Prostate Cancer. Journal of the National Cancer Institute. 111 (3), 311-321 (2018).
- McConnell, A. M., et al. p53 Regulates Progenitor Cell Quiescence and Differentiation in the Airway. Cell Reports. 17 (9), 2173-2182 (2016).
- Li, L., et al. Superficial cells are self-renewing chondrocyte progenitors, which form the articular cartilage in juvenile mice. Faseb Journal. 31 (3), 1067-1084 (2017).
- Newton, P. T., et al. A radical switch in clonality reveals a stem cell niche in the epiphyseal growth plate. Nature. 567 (7747), 234-238 (2019).
- Kaucka, M., et al. Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage. eLife. 6, 25902 (2017).
- Kozhemyakina, E., et al. Identification of a Prg4-expressing articular cartilage progenitor cell population in mice. Arthritis Rheumatology. 67 (5), 1261-1273 (2015).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreERT to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Developmental Dynamics. 235 (9), 2603-2612 (2006).
- Mizuhashi, K., et al. Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells. Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).
- Reinert, R. B., et al. Tamoxifen-Induced Cre loxP Recombination Is Prolonged in Pancreatic Islets of Adult Mice. PloS One. 7 (3), 33529 (2012).
- Kim, I. S., et al. In vitro response of primary human bone marrow stromal cells to recombinant human bone morphogenic protein-2 in the early and late stages of osteoblast differentiation. Development, Growth & Differentiation. 50 (7), 553-564 (2008).
- Fang, X., Gyabaah, K., Nickkholgh, B., Cline, J. M., Balaji, K. C. Novel In Vivo model for combinatorial fluorescence labeling in mouse prostate. The Prostate. 75 (9), 988-1000 (2015).
- Newton, P. T., Xie, M., Medvedeva, E. V., Sävendahl, L., Chagin, A. S. Activation of mTORC1 in chondrocytes does not affect proliferation or differentiation, but causes the resting zone of the growth plate to become disordered. Bone Reports. 8, 64-71 (2018).
- Xie, M., et al. Schwann cell precursors contribute to skeletal formation during embryonic development in mice and zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (30), 15068-15073 (2019).
