Imaging e analisi dell'orientamento dei tessuti e delle dinamiche di crescita nell'epiteliale della Drosophila in via di sviluppo durante le fasi pupali
Summary
Questo protocollo è progettato per l’imaging e l’analisi delle dinamiche dell’orientamento cellulare e della crescita dei tessuti nell’epitelio addominale della Drosophila mentre la mosca della frutta subisce la metamorfosi. La metodologia qui descritta può essere applicata allo studio di diverse fasi di sviluppo, tessuti e strutture subcellulari nella Drosophila o in altri organismi modello.
Abstract
All’interno di organismi multicellulari, tessuti e organi maturi mostrano alti gradi di ordine nelle disposizioni spaziali delle loro cellule costituenti. Un esempio notevole è dato da epiteli sensoriali, dove cellule della stessa identità o identità distinte sono riunite attraverso l’adesione delle cellule cellulari che mostra modelli planari altamente organizzati. Le celle si allineano l’una all’altra nella stessa direzione e mostrano polarità equivalente su grandi distanze. Questa organizzazione dell’epitelia matura è stabilita nel corso della morfogenesi. Per capire come si ottiene la disposizione planare dell’epitelio maturo, è fondamentale monitorare l’orientamento cellulare e le dinamiche di crescita con alta fedeltà spatiotemporale durante lo sviluppo in vivo. Strumenti analitici robusti sono inoltre essenziali per identificare e caratterizzare le transizioni da locale a globale. La pupa della Drosophila è un sistema ideale per valutare i cambiamenti di forma cellulare orientata alla base della morfogenesi epiteliale. L’epitelio pupali in via di sviluppo costituisce la superficie esterna del corpo immobile, consentendo l’imaging a lungo termine di animali intatti. Il protocollo qui descritto è progettato per immaginare e analizzare i comportamenti cellulari sia a livello globale che locale nell’epidermide addominale pupale man mano che cresce. La metodologia descritta può essere facilmente adattata all’imaging di comportamenti cellulari in altri stadi dello sviluppo, tessuti, strutture subcellulari o organismi modello.
Introduction
Per ottenere i loro ruoli, i tessuti epiteliali si basano completamente sull’organizzazione spaziale dei loro componenti cellulari. Nella maggior parte degli epiteli, le cellule non solo sono imballate l’una contro l’altra per creare un preciso strato di ciottoli, ma si orientano rispetto agli assi del corpo.
L’importanza funzionale dell’organizzazione precisa dei tessuti è evidente negli epitelia sensoriali, come l’orecchio interno vertebrato e la retina. Nel primo caso, i capelli e le cellule di supporto si allineano in una direzione assiale specifica per rilevare in modo efficiente gli ingressi meccanici come il suono e il movimento1,2. Allo stesso modo, l’organizzazione spaziale delle cellule fotorecettori è essenziale per ottenere proprietà ottiche ottimali dalla retina3. Il controllo spaziale della posizione e dell’orientamento cellulare è quindi di particolare rilevanza per una corretta funzione fisiologica.
La drosophila è un insetto olometabolo che subisce una completa trasformazione delle sue strutture del corpo larvale attraverso la metamorfosi, dando origine ai suoi tessuti adulti. La pupa della Drosophila è un modello eccellente per l’imaging dal vivo non invasivo di una varietà di eventi dinamici, tra cui migrazione cellulare dello sviluppo4, divisione cellulare e dinamica di crescita5, contrazione muscolare6, morte cellulare7, riparazione della ferita8e orientamento cellulare9. Nell’adulto Drosophila, l’epitelio esterno mostra un alto grado di ordine. Questo è facilmente osservabile sulle disposizioni dei tricomi (cioè le sporche cellulari provenienti da singole cellule epiteliali) e le setole sensoriali su tutta la superficie corporea della mosca10. Infatti, i tricomi sono allineati in file parallele che guidano il flusso d’aria11. La morfogenesi dell’epitelia adulta e la disposizione ordinata delle singole cellule inizia durante l’embriogenesi e culmina durante le fasi puupali. Mentre negli embrioni divisioni cellulari, interlezioni e cambiamenti di forma diminuiscono tutti l’ordine dei tessuti12,13, questo viene ripristinato nelle fasi successive dello sviluppo, soprattutto nelle fasi pupali, quando la mosca si avvicina alla maturità9.
La pupa di Drosophila immobile fornisce un sistema ideale per valutare i cambiamenti di forma e orientamento delle cellule. L’epidermide addominale pupa presenta vantaggi speciali. Mentre i precursori della testa adulta, del torace, dei genitali e delle appendici crescono e si modellano da stadi larve, gli istoblasti, che sono integrati nell’epidermide larvale, iniziano a crescere e differenziarsi solo a pupariation14. Questa caratteristica consente il monitoraggio di tutti gli eventi spatiotemporali coinvolti nella creazione di ordine tissutale nella sua interezza9.
Gli istoblasti sono specificati durante lo sviluppo embrionale in posizioni contralaterali in ogni segmento addominale presuntivo. L’epidermide addominale dorsale dell’adulto deriva da nidi di istoblasto dorsolaterale presenti nei compartimenti anteriori e posteriori15,16. Mentre gli istoblasti si espandono, sostituendo le cellule epiteliali larve (LEC), i nidi contralaterali si fondono alla linea mediana dorsale formando un foglio confluente17,18,19,20.20
Questo lavoro descrive 1) una metodologia per la dissezione, il montaggio e l’imaging dal vivo a lungo termine delle pupe della Drosophila, e 2) metodi analitici per studiare le dinamiche dell’orientamento cellulare e della crescita ad alta risoluzione spatiotemporale. Qui viene fornito un protocollo dettagliato che copre tutti i passaggi necessari dalla preparazione iniziale delle pupe (ad esempio, la messa in scena e l’imaging) all’estrazione e quantificazione delle caratteristiche di direzionalità e orientamento. Descriviamo anche come dedurre le proprietà dei tessuti locali dall’analisi dei cloni cellulari. Tutti i passaggi descritti sono minimamente invasivi e consentono analisi dal vivo a lungo termine. I metodi qui descritti possono essere facilmente adattati e applicati ad altri stadi di sviluppo, tessuti o organismi modello.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ordine a lungo raggio è una caratteristica essenziale della maggior parte delle unità fisiologiche funzionali. Durante la morfogenesi, l’ordine si ottiene attraverso l’integrazione di istruzioni complesse implementate con alta precisione temporale e spaziale. I vincoli multipli e multilivello sono integrati in disposizioni tissutali stereotitipati.
Polarità e direzionalità sono fondamentali per una disposizione spaziale ordinata durante lo sviluppo. Polarità implica rottura di simmetria…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio Martàn-Blanco per le discussioni utili. Ringraziamo anche Nic Tapon (The Crick Institute, Londra, Regno Unito), il Bloomington Stock Center (Università dell’Indiana, USA) e FlyBase (per l’annotazione genica Drosophila). Federica Mangione è stata sostenuta da una borsa di studio pre-dottorato JAE-CSIC. Il laboratorio di Martàn-Blanco è stato finanziato dalla Programa Estatal de Fomento de la Investigaciàn Cient-fica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P e BFU2017-82876-P) e dal Fundaciàn Ramàn Areces.
Materials
| Analysis Software | – | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | – | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | – | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
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