Изображение и анализ ориентации тканей и динамики роста в развивающихся дрозофилы Эпителия во время Pupal Этапы

Для достижения своей роли эпителиальные ткани полностью полагаются на пространственную организацию своих клеточных компонентов. В большинстве эпителий клетки не только упакованы друг против друга, чтобы создать точный слой булыжника, но они ориентируются относительно осей тела.

Функциональное значение точной организации тканей очевидно в сенсорных эпителиях, таких как позвоночное внутреннее ухо и сетчатка. В первом случае волосы и поддерживающие клетки выравниваются в определенном осевом направлении, чтобы эффективно чувствовать механические входы, такие как звук и движение^1,2. Аналогичным образом, фоторецептор клеточной пространственной организации имеет важное значение для достижения оптимальных оптических свойств сетчатки³. Таким образом, пространственный контроль положения и ориентации клеток имеет особое значение для правильной физиологической функции.

Дрозофила является голометаболическим насекомым, которое претерпевает полное преобразование своих личинок структуры тела через метаморфозы, что приводит к его взрослых тканей. Дрозофила кукапа является отличной моделью для неинвазивных живой визуализации различных динамических событий, в том числе миграции клеток^{развития 4}, деление клеток и динамика роста⁵, сокращение мышц⁶, гибель клеток⁷, ремонт ран^{ы 8}, и ориентация клеток⁹. У взрослой дрозофилы, внешний эпителий показывает высокую степень порядка. Это легко наблюдается на расположения трихом (т.е. выступы клеток, происходящих из отдельных эпителиальных клеток) и сенсорных щетины по всей поверхности тела мухи¹⁰. Действительно, трихом выровнены в параллельных рядах, направляющих воздушный поток^11. Морфогенез эпителии взрослых и упорядоченное расположение отдельных клеток начинается во время эмбриогенеза и завершается во время стадии pupal. В то время как в эмбрионах клеточные деления, интеркалации и формы изменяют все уменьшающееся предельное управление ткани^12,,13, это возвращается на более поздних стадиях развития, особенно на стадиях pupal, когда муха приближается к зрелости^9.

Неподвижный кукачанка Drosophila обеспечивает идеальную систему для оценки формы клеток и изменения ориентации. Особой преимуществаю является эпидермис брюшной полости. В то время как предшественники взрослой головы, грудной клетки, гениталий и придатков растут и получают узоризм из личинок этапов, гистопласты, которые интегрированы в личиночной эпидермис, начинают расти и дифферециации только при pupariation¹⁴. Эта функция позволяет отслеживать все пространственно-временные события, участвующие в создании порядка тканей в полном объеме⁹.

Гистобласты определяются во время эмбрионального развития на контралатеральных позициях в каждом предполагаемом брюшном сегменте. В рознические брюшной эпидермис взрослого происходит от дорсолатерально расположен гистобласт гнезда, присутствующие в передней и задней отсеков^15,16. По мере расширения гистопластов, заменяющих личиночные эпителиальные клетки (ЛЭК), контралатеральные гнезда предохраняют на дозорной средней линии, образуя конфлюентный лист^{17,,18,,19,20}.

Эта работа описывает 1) методологию для вскрытия, монтажа и долгосрочной живой визуализации кукота Drosophila, и 2) аналитические методы для изучения динамики клеточной ориентации и роста при высоком пространственно-временном разрешении. Здесь представлен подробный протокол, охватывающий все шаги, необходимые от первоначальной подготовки куколок (т.е. постановки и визуализации) до извлечения и количественной оценки функций направленности и ориентации. Мы также описываем, как сделать вывод о местных свойствах тканей из анализа клеточных клонов. Все описанные шаги являются минимально инвазивными и позволяют проводить долгосрочный живой анализ. Описанные здесь методы могут быть легко адаптированы и применены к другим стадиям развития, тканям или модельным организмам.