Bildgebung und Analyse der Gewebeorientierung und Wachstumsdynamik in der Entwicklung drosophila Epithelia während der Pupal-Stadien
Summary
Dieses Protokoll ist für die Bildgebung und Analyse der Dynamik der Zellorientierung und des Gewebewachstums in der Drosophila-Bauchepithelie konzipiert, während die Fruchtfliege einer Metamorphose unterzogen wird. Die hier beschriebene Methodik kann auf die Untersuchung verschiedener Entwicklungsstadien, Gewebe und subzellulärer Strukturen in Drosophila oder anderen Modellorganismen angewendet werden.
Abstract
Innerhalb mehrzelliger Organismen weisen reife Gewebe und Organe hohe Ordnungsgrade in den räumlichen Anordnungen ihrer Konstituentenzellen auf. Ein bemerkenswertes Beispiel ist die sensorische Epithelie, bei der Zellen der gleichen oder unterschiedlichen Identitäten über die Zell-Zell-Adhäsion zusammengeführt werden, die hochorganisierte planare Muster zeigt. Zellen richten sich in der gleichen Richtung aneinander aus und zeigen über große Entfernungen eine äquivalente Polarität an. Diese Organisation der reifen Epithelie wird im Laufe der Morphogenese etabliert. Um zu verstehen, wie die planare Anordnung der reifen Epithelie erreicht wird, ist es entscheidend, die Zellorientierung und Wachstumsdynamik mit hoher raumzeitlicher Genauigkeit während der Entwicklung in vivo zu verfolgen. Robuste Analysetools sind auch unerlässlich, um lokale zu globale Übergänge zu identifizieren und zu charakterisieren. Die Drosophila-Pupa ist ein ideales System zur Bewertung orientierter Zellformveränderungen, die der epitheliaalen Morphogenese zugrunde liegen. Das pupal entwickelnde Epithel bildet die äußere Oberfläche des unbeweglichen Körpers und ermöglicht eine langfristige Bildgebung intakter Tiere. Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um Zellverhalten sowohl auf globaler als auch auf lokaler Ebene in der pupalen Abdominalepidermis zu abbilden und zu analysieren, während es wächst. Die beschriebene Methodik kann leicht an die Abbildung von Zellverhalten in anderen Entwicklungsstadien, Geweben, subzellulären Strukturen oder Modellorganismen angepasst werden.
Introduction
Um ihre Rolle zu erfüllen, verlassen sich Epithelgewebe voll und ganz auf die räumliche Organisation ihrer zellulären Komponenten. In den meisten Epithelien werden Zellen nicht nur gegeneinander gepackt, um eine präzise Kopfsteinpflasterschicht zu schaffen, sondern sie orientieren sich relativ zu den Körperachsen.
Die funktionelle Bedeutung einer präzisen Gewebeorganisation wird bei sensorischen Epithelien wie dem Wirbeltier-Innenohr und der Netzhaut deutlich. Im ersten Fall richten sich Haar- und Stützzellen in eine bestimmte axiale Richtung aus, um mechanische Eingänge wie Schall und Bewegung1,2effizient zu erkennen. In ähnlicher Weise ist die räumliche Organisation der Photorezeptorzellen unerlässlich, um optimale optische Eigenschaften durch die Netzhaut zu erreichen3. Die räumliche Kontrolle der Zellposition und -orientierung ist daher von besonderer Bedeutung für die richtige physiologische Funktion.
Drosophila ist ein holometabolous Insekt, das eine vollständige Transformation seiner Larvenkörperstrukturen durch Metamorphose durchläuft, was zu seinem erwachsenen Gewebe führt. Die Drosophila Pupa ist ein ausgezeichnetes Modell für die nichtinvasive Live-Bildgebung einer Vielzahl von dynamischen Ereignissen, einschließlich Entwicklungszellmigration4, Zellteilung und Wachstumsdynamik5, Muskelkontraktion6, Zelltod7, Wundreparatur8und Zellorientierung9. Bei der erwachsenen Drosophilaweist das äußere Epithel einen hohen Ordnungsgrad auf. Dies ist leicht an der Anordnung von Trichomen (d.h. Zellvorsprüngen, die aus einzelnen Epithelzellen stammen) und sensorischen Borsten auf der gesamten Körperoberfläche der Fliege10zu beobachten. Tatsächlich sind Trichome in parallelen Reihen ausgerichtet, die den Luftstrom11leiten. Die Morphogenese der adulten Epithelie und die geordnete Anordnung der einzelnen Zellen beginnt während der Embryogenese und kulminiert in pupalen Stadien. Während in Embryonen Zellteilungen, Intercalationen und Formänderungen alle verringern Gewebeordnung12,13, wird dies in späteren Stadien der Entwicklung, vor allem in Pupal-Stadien, wenn die Fliege nähert Reife9.
Die immobile Drosophila pupa bietet ein ideales System zur Bewertung von Zellform- und Orientierungsänderungen. Die pupalabdominale Epidermis bietet besondere Vorteile. Während die Vorläufer des erwachsenen Kopfes, Thorax, Genitalien und Anhängsel wachsen und aus Larvenstadien gemustert werden, beginnen die Histoblasten, die in die Larvenepidermis integriert sind, erst bei der Verpuptaration zu wachsen und zu differenzieren14. Diese Funktion ermöglicht die Verfolgung aller räumlich-zeitlichen Ereignisse, die an der Etablierung der Gewebeordnung in ihrer Gesamtheit beteiligt sind9.
Histoblasten werden während der embryonalen Entwicklung an kontralateralen Positionen in jedem mutmaßlichen Bauchsegment spezifiziert. Die dorsale Abdominalepidermis des Erwachsenen leitet sich von dorsolater lokalisierten Histoblastnestern ab, die an den vorderen und hinteren Fächern15,16vorhanden sind. Wenn sich Histoblasten ausdehnen und die Larvenepithelzellen (LECs) ersetzen, verschmelzen die kontralateralen Nester an der dorsalen Mittellinie und bilden ein Konfluentblatt17,18,19,20.
Diese Arbeit beschreibt 1) eine Methodik zur Zerlegung, Montage und langfristigen Live-Bildgebung der Drosophila-Pupae und 2) Analysemethoden, um die Dynamik der zellulären Orientierung und des Wachstums bei hoher raumzeitlicher Auflösung zu untersuchen. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Verfügung gestellt, das alle erforderlichen Schritte von der ersten Pupae-Vorbereitung (d.h. Inszenierung und Bildgebung) bis hin zur Extraktion und Quantifizierung von Richtungs- und Orientierungsmerkmalen abdeckt. Wir beschreiben auch, wie lokale Gewebeeigenschaften aus der Analyse von Zellklonen ableiten. Alle beschriebenen Schritte sind minimalinvasiv und ermöglichen langfristige Live-Analysen. Die hier beschriebenen Methoden können leicht angepasst und auf andere Entwicklungsstadien, Gewebe oder Modellorganismen angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Langfristige Ordnung ist ein wesentliches Merkmal der meisten funktionellen physiologischen Einheiten. Bei der Morphogenese wird Ordnung durch die Integration komplexer Instruktionen erreicht, die mit hoher zeitlicher und räumlicher Präzision umgesetzt werden. Mehrere und mehrstufige Konsprossen sind in stereotype Gewebeanordnungen integriert.
Polarität und Richtung sind entscheidend für eine geordnete räumliche Anordnung während der Entwicklung. Polarität impliziert Symmetriebruch …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern des Labors von Martin-Blanco für die hilfreichen Diskussionen. Wir danken auch Nic Tapon (The Crick Institute, London, UK), dem Bloomington Stock Center (University of Indiana, USA) und FlyBase (für Drosophila Gen Anmerkung). Federica Mangione wurde von einem JAE-CSIC Predoctoral Fellowship unterstützt. Finanziert wurde das Labor von Martén-Blanco aus dem Programa Estatal de Fomento de la Investigacion Cientéfica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P und BFU2017-82876-P) und der Fundacion Ramén Areces.
Materials
| Analysis Software | – | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | – | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | – | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
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