Imágenes y análisis de la orientación del tejido y la dinámica del crecimiento en el desarrollo de la Drosophila Epithelia durante las etapas pupales

Para lograr sus funciones, los tejidos epiteliales dependen plenamente de la organización espacial de sus componentes celulares. En la mayoría de las epitelias, las células no sólo se embalan unas contra otras para crear una capa de adoquines precisa, sino que se orientan en relación con los ejes del cuerpo.

La importancia funcional de la organización precisa del tejido es evidente en la epitelia sensorial, como el oído interno vertebrado y la retina. En el primer caso, el cabello y las células de apoyo se alinean en una dirección axial específica para detectar eficientemente entradas mecánicas como el sonido y el movimiento^1,2. Del mismo modo, la organización espacial de las células fotorreceptores es esencial para lograr propiedades ópticas óptimas por la retina^3. Por lo tanto, el control espacial de la posición y la orientación de la célula es de particular relevancia para la función fisiológica adecuada.

Drosophila es un insecto holometaboloso que sufre una transformación completa de sus estructuras corporales larvales a través de la metamorfosis, dando lugar a sus tejidos adultos. La Drosophila pupa es un excelente modelo para la imagen en vivo no invasiva de una variedad de eventos dinámicos, incluyendo la migración celular del desarrollo^4,división celular y dinámica de crecimiento⁵, contracción muscular⁶, muerte celular⁷, reparación de^{heridas 8}, y orientación celular⁹. En el Drosophilaadulto, el epitelio externo muestra un alto grado de orden. Esto se observa fácilmente en los arreglos de los tricomas (es decir, las protuberancias celulares procedentes de células epiteliales individuales) y las cerdas sensoriales en toda la superficie corporal de la mosca¹⁰. De hecho, los tricomas están alineados en filas paralelas que guían el flujo de aire¹¹. La morfogénesis de la epitelia adulta y la disposición ordenada de las células individuales comienza durante la embriogénesis y culmina durante las etapas pupales. Mientras que en las divisiones celulares embrionarias, intercalaciones, y cambios de forma todos disminuyen el orden^tisular12,¹³, esto se revierte en etapas posteriores de desarrollo, especialmente en etapas pupales, cuando la mosca se acerca a la madurez⁹.

La pupa Drosophila inmóvil proporciona un sistema ideal para evaluar la forma de la célula y los cambios de orientación. La epidermis abdominal pupal presenta ventajas especiales. Mientras que los precursores de la cabeza adulta, tórax, genitales, y apéndices crecen y se modelan desde etapas larvales, los histoblastos, que se integran en la epidermis larvaria, comienzan a crecer y diferenciar sólo en la pupariación¹⁴. Esta característica permite el seguimiento de todos los eventos espaciotemporales involucrados en el establecimiento del orden de los tejidos en su totalidad⁹.

Los histoblastos se especifican durante el desarrollo embrionario en posiciones contralaterales en cada segmento abdominal presuntivo. La epidermis abdominal dorsal del adulto deriva de nidos histoblastos localizados dorsolateralmente presentes en los compartimentos anterior y posterior^15,,16. A medida que los histoblastos se expanden, reemplazando las células epiteliales larvales (LEC), los nidos contralaterales se fusionan en la línea media dorsal formando una hoja confluente^17,18,19,20.

Este trabajo describe 1) una metodología para la disección, el montaje y la imagen en vivo a largo plazo de las drosophila pupae, y 2) métodos analíticos para estudiar la dinámica de la orientación celular y el crecimiento a alta resolución espaciotemporal. Aquí se proporciona un protocolo detallado, que abarca todos los pasos necesarios desde la preparación inicial de las pupas (es decir, la puesta en escena y la imagen) hasta la extracción y cuantificación de las características de direccionalidad y orientación. También describimos cómo inferir propiedades de tejido local del análisis de clones celulares. Todos los pasos descritos son mínimamente invasivos y permiten análisis en vivo a largo plazo. Los métodos descritos aquí se pueden adaptar y aplicar fácilmente a otras etapas del desarrollo, tejidos u organismos modelo.