التصوير والتحليل لاتجاهات الأنسجة وديناميات النمو في الظهارة الهوائية النامية Drosophila خلال مراحل البوبال
Summary
تم تصميم هذا البروتوكول لتصوير وتحليل ديناميات اتجاه الخلية ونمو الأنسجة في ظهارة البطن Drosophila كما ذبابة الفاكهة يخضع التحول. يمكن تطبيق المنهجية الموصوفة هنا على دراسة مختلف مراحل النمو والأنسجة والهياكل تحت الخلوية في دروسوفيلا أو غيرها من الكائنات النموذجية.
Abstract
داخل الكائنات متعددة الخلايا ، والأنسجة الناضجة والأجهزة عرض درجات عالية من النظام في الترتيبات المكانية للخلايا المكونة لها. وهناك مثال رائع من النعت الحسي، حيث يتم جمع خلايا من نفس الهويات أو الهويات المتميزة معا عبر التصاق الخلية الخلية تظهر أنماط بلازار منظمة للغاية. الخلايا محاذاة إلى بعضها البعض في نفس الاتجاه وعرض قطبية مكافئة على مسافات كبيرة. يتم تأسيس هذه المنظمة من النعت ناضجة على مدى مورفوجينيسيس. لفهم كيفية تحقيق الترتيب البُلّي ّ للنعت الناضج ، من الأهمية بمكان تتبع اتجاه الخلية وديناميكيات النمو مع الإخلاص الصدغي العالي أثناء التطور في الجسم الحي. كما أن الأدوات التحليلية القوية ضرورية لتحديد وتوصيف التحولات المحلية إلى العالمية. وpupa Drosophila هو نظام مثالي لتقييم التغييرات شكل الخلية الموجهة الكامنة وراء مورثوجينيسيس الظهارية. تشكل ظهارة الظهارة النامية للظهارة السطح الخارجي للجسم غير المتنقل ، مما يسمح بالتصوير على المدى الطويل للحيوانات السليمة. تم تصميم البروتوكول الموصوف هنا لتصوير وتحليل سلوكيات الخلايا على المستويين العالمي والمحلي في البشرة البطنية الجروية أثناء نموها. يمكن تكييف المنهجية الموصوفة بسهولة مع تصوير سلوكيات الخلايا في مراحل النمو الأخرى أو الأنسجة أو الهياكل تحت الخلية أو الكائنات الحية النموذجية.
Introduction
لتحقيق أدوارها، الأنسجة الظهارية تعتمد بشكل كامل على التنظيم المكاني لمكوناتها الخلوية. في معظم النعوت، لا يتم تعبئة الخلايا ضد بعضها البعض فقط لإنشاء طبقة حصوية دقيقة ولكنها توجه نفسها نسبة إلى محاور الجسم.
الأهمية الوظيفية لتنظيم الأنسجة الدقيقة واضحة في الظهارة الحسية ، مثل الأذن الداخلية الفقارية وشبكية العين. في الحالة الأولى ، الشعر والخلايا الداعمة محاذاة في اتجاه محوري محدد لاستشعار كفاءة المدخلات الميكانيكية مثل الصوت والحركة1،2. وبالمثل، فإن التنظيم المكاني لخلية المستقبلالضوئي ضروري لتحقيق الخصائص البصرية المثلى من قبل شبكية العين3. وبالتالي فإن التحكم المكاني في موضع الخلية واتجاهها له أهمية خاصة بالنسبة للوظيفة الفسيولوجية المناسبة.
Drosophila هي حشرة ثلاثية الأبعاد تخضع لتحول كامل في هياكل جسم اليرقات من خلال التحول ، مما يؤدي إلى أنسجة البالغين. وpupa Drosophila هو نموذج ممتاز للتصوير الحي غير الغازية من مجموعة متنوعة من الأحداث الديناميكية، بما في ذلك هجرة الخلايا التنموية4،انقسام الخلية وديناميات النمو5،تقلص العضلات6،موت الخلية7،إصلاح الجرح8،واتجاه الخلية9. في دروسوفيلاالكبار ، يظهر الظهارة الخارجية درجة عالية من النظام. ويلاحظ هذا بسهولة على ترتيبات trichomes (أي نتوءات الخلايا الناشئة من الخلايا الظهارية واحدة) وشعيرات الحسية في جميع أنحاء سطح الجسم ذبابة10. في الواقع، يتم محاذاة trichomes في صفوف متوازية توجيه تدفق الهواء11. يبدأ تكوين الظهارة للبالغين والترتيب المنظم للخلايا الفردية أثناء تكوين الجنين ويتوج خلال مراحل الجرو. بينما في الأجنة أقسام الخلية، intercalations، وشكل التغييرات جميع انخفاض ترتيب الأنسجة12،13، وهذا هو عاد في مراحل لاحقة من التنمية ، وخاصة في مراحل الجرو ، عندما تقترب الذبابة النضج9.
يوفر جرو Drosophila غير المتنقل نظامًا مثاليًا لتقييم شكل الخلية وتغيرات الاتجاه. البشرة البطنية الجروية يقدم مزايا خاصة. في حين أن السلائف من رئيس الكبار، الصدر، الأعضاء التناسلية، والزوائد تنمو والحصول على منقوشة من مراحل اليرقات، والبلس، والتي يتم دمجها في البشرة اليرقات، تبدأ في النمو والتمييز فقط في pupariation14. تسمح هذه الميزة بتتبع جميع الأحداث الزمنية المكانية التي ينطوي عليها إنشاء ترتيب الأنسجة في مجملها9.
يتم تحديد البلس أثناء النمو الجنيني في المواقف المخالفة في كل جزء من أجزاء البطن المفترضة. البشرة البطنية الظهرية للبالغين مشتقة من أعشاش الهيستوبلاستقع الظهرية الموجودة في المقصورات الأمامية والخلفية15،16. كما توسع الهيستوبلاسس، واستبدال الخلايا الظهارية اليرقات (LECs)، والأعشاش الكونترافين الصمامات في خط الوسط الظهري تشكيل ورقة ملتوية17،18،19،20.
يصف هذا العمل 1) منهجية للتشريح، وتركيب، والتصوير الحي على المدى الطويل من الخوخ Drosophila، و 2) الطرق التحليلية لدراسة ديناميات التوجه الخلوي والنمو في دقة زمنية عالية. يتم توفير بروتوكول مفصل هنا ، يغطي جميع الخطوات المطلوبة من إعداد الخوخ الأولي (أي التدريج والتصوير) إلى استخراج وتقدير خصائص الاتجاه والتوجيه. كما أننا نصف كيفية استنتاج خصائص الأنسجة المحلية من تحليل استنساخ الخلايا. جميع الخطوات الموصوفة هي الحد الأدنى من الغازية وتسمح بإجراء تحليلات حية على المدى الطويل. يمكن تكييف الأساليب الموصوفة هنا بسهولة وتطبيقها على مراحل النمو الأخرى أو الأنسجة أو الكائنات الحية النموذجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
النظام بعيد المدى هو سمة أساسية لمعظم الوحدات الفسيولوجية الوظيفية. خلال تكوين الشكل ، يتم تحقيق النظام من خلال دمج التعليمات المعقدة التي يتم تنفيذها بدقة زمنية ومكانية عالية. يتم دمج القيود متعددة المستويات والمتعددة المستويات في ترتيبات الأنسجة النمطية.
القطبية والاتج…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر أعضاء مختبر مارتين – بلانكو على المناقشات المفيدة. كما نشكر Nic Tapon (معهد كريك، لندن، المملكة المتحدة)، ومركز بلومينغتون للأوراق المالية (جامعة إنديانا، الولايات المتحدة الأمريكية) وFlyBase (للشرح الجيني Drosophila). تم دعم فيديريكا مانجيون من قبل زمالة ما قبل الدكتوراه من JAE-CSIC. تم تمويل مختبر مارتن بلانكو من Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P و BFU2017-82876-P) ومن Fundación Ramón Areces.
Materials
| Analysis Software | – | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | – | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | – | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae. Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).
- Stell, W. K. The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus. Comparative Biochemistry and Physiology – Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336, 724-727 (2012).
- Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
- Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium. Development. 144, 95-105 (2017).
- Weavers, H., et al. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).
- Mangione, F., Martin-Blanco, E. The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen. Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).
- Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. Developmental compartments and planar polarity in Drosophila. Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).
- Wootton, R. How flies fly. Nature. 400, 112-113 (1999).
- Zallen, J. A., Wieschaus, E. Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila. Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).
- Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux’s archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).
- Kornberg, T. Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus. Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).
- Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. Clonal parameters of tergite development in Drosophila. Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).
- Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux’s archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).
- Madhavan, M. M., Madhavan, K. Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40, 2552-2556 (2009).
- Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).
- Hammer, &. #. 2. 1. 6. ;., Harper, D. A., Ryan, P. D. PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).
- Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity. Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).
- Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity. Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).
- Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension. Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).
- Martin-Blanco, E., et al. puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila. Genes and Development. 12, 557-570 (1998).
- Dye, N. A., et al. Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144, 4406-4421 (2017).
- Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis. Development. 124, 2889-2901 (1997).
- Ferguson, M. W. Palate development. Development. 103, 41-60 (1988).
