Beeldvorming en analyse van weefseloriëntatie en groeidynamiek in de ontwikkeling van Drosophila Epithelia tijdens pupale stadia
Summary
Dit protocol is ontworpen voor de beeldvorming en analyse van de dynamiek van celoriëntatie en weefselgroei in de Drosophila abdominale epithelia terwijl de fruitvlieg een metamorfose ondergaat. De hier beschreven methodologie kan worden toegepast op de studie van verschillende ontwikkelingsstadia, weefsels en subcellulaire structuren in Drosophila of andere modelorganismen.
Abstract
Binnen meercellige organismen vertonen rijpe weefsels en organen een hoge mate van orde in de ruimtelijke ordening van hun samenstellende cellen. Een opmerkelijk voorbeeld wordt gegeven door zintuiglijke epithelia, waar cellen van dezelfde of verschillende identiteiten worden samengebracht via celcelhechting met zeer georganiseerde planaire patronen. Cellen uitlijnen op elkaar in dezelfde richting en tonen gelijkwaardige polariteit over grote afstanden. Deze organisatie van de rijpe epithelia wordt opgericht in de loop van morfogenese. Om te begrijpen hoe de vlakke opstelling van de volwassen epithelia wordt bereikt, is het cruciaal om celoriëntatie en groeidynamiek te volgen met een hoge spatiotemporale getrouwheid tijdens de ontwikkeling in vivo. Robuuste analytische instrumenten zijn ook essentieel om lokale-naar-wereldwijde overgangen te identificeren en te karakteriseren. De Drosophila pop is een ideaal systeem om georiënteerde celvormveranderingen te evalueren die ten grondslag liggen aan epitheelmorogenese. Het pupale ontwikkelende epitheel vormt het buitenoppervlak van het onbeweeglijke lichaam, waardoor op lange termijn beeldvorming van intacte dieren mogelijk is. Het hier beschreven protocol is ontworpen om celgedrag op zowel mondiaal als lokaal niveau in de pop abdominale opperhuid te beeld en te analyseren terwijl het groeit. De beschreven methodologie kan gemakkelijk worden aangepast aan de beeldvorming van celgedrag in andere ontwikkelingsstadia, weefsels, subcellulaire structuren of modelorganismen.
Introduction
Om hun rol te bereiken, epitheelweefsels volledig vertrouwen op de ruimtelijke organisatie van hun cellulaire componenten. In de meeste epithelia, cellen zijn niet alleen verpakt tegen elkaar om een nauwkeurige kasseienlaag te creëren, maar ze oriënteren zich ten opzichte van het lichaam assen.
Het functionele belang van nauwkeurige weefselorganisatie is duidelijk in zintuiglijke epithelia, zoals het gewervelde binnenoor en het netvlies. In het eerste geval richten haar- en ondersteunende cellen zich in een specifieke axiale richting om mechanische ingangen zoals geluid en beweging1,2efficiënt te voelen . Op dezelfde manier is fotoreceptorcel ruimtelijke organisatie essentieel voor het bereiken van optimale optische eigenschappen door het netvlies3. Ruimtelijke controle van de celpositie en oriëntatie is dus van bijzonder belang voor een goede fysiologische functie.
Drosophila is een holometaboleus insect dat een volledige transformatie van zijn larve lichaamsstructuren ondergaat door middel van metamorfose, wat aanleiding geeft tot zijn volwassen weefsels. De Drosophila pop is een uitstekend model voor de niet-invasieve live beeldvorming van een verscheidenheid aan dynamische gebeurtenissen, waaronder ontwikkelingscelmigratie4,celdeling en groeidynamiek5, spiercontractie6, celdood7, wondherstel8en celoriëntatie9. In de volwassen Drosophilavertoont het externe epitheel een hoge mate van orde. Dit wordt gemakkelijk waargenomen op de regelingen van trichomen (d.w.z. celuitsteeksels afkomstig van enkele epitheelcellen) en sensorische haren over het hele lichaamsoppervlak van de vlieg10. Trichomen zijn namelijk uitgelijnd in parallelle rijen die de luchtstroom11begeleiden . De morfogenese van de volwassen epithelia en de geordende opstelling van de individuele cellen begint tijdens embryogenese en culmineert tijdens de popstadia. Terwijl in embryo’s celdelingen, intercalaties en vormveranderingen alle afname weefselorde12,13, wordt dit in latere stadia van ontwikkeling, vooral in pupale stadia, wanneer de vlieg rijpheid9nadert .
De immobiele Drosophila pop biedt een ideaal systeem om veranderingen in de celvorm en oriëntatie te evalueren. De pop abdominale opperhuid biedt speciale voordelen. Terwijl de voorlopers van het volwassen hoofd, thorax, genitaliën en aanhangsels groeien en een patroon krijgen van larvestadia, beginnen de histoblasten, die zijn geïntegreerd in de larve opperhuid, te groeien en te differentiëren alleen bij pupariatie14. Deze functie maakt het mogelijk om alle spatiotemporale gebeurtenissen te volgen die betrokken zijn bij de vaststelling van weefselorde in zijn geheel9.
Histoblasten worden gespecificeerd tijdens de embryonale ontwikkeling op contralaterale posities in elk vermoedelijke buiksegment. De rugbuispieroppermis van de volwassene is afgeleid van dorsolateraal gelegen histoblast nesten aanwezig op de voorste en achterste compartimenten15,16. Terwijl histoblasten zich uitbreiden en de larve epitheelcellen (LECs) vervangen, smelten de contralaterale nesten samen op de dorsale middellijn die een samenvloeiend blad17,18,19,20vormt .
Dit werk beschrijft 1) een methodologie voor dissectie, montage, en lange termijn live beeldvorming van de Drosophila pop, en 2) analytische methoden om de dynamiek van cellulaire oriëntatie en groei te bestuderen bij hoge spatiotemporale resolutie. Hier wordt een gedetailleerd protocol verstrekt, dat alle stappen omvat die nodig zijn vanaf het eerste poppenpreparaat (d.w.z. enscenering en beeldvorming) tot de extractie en kwantificering van directionaliteit en oriëntatiekenmerken. We beschrijven ook hoe lokale weefseleigenschappen kunnen afleiden uit de analyse van celklonen. Alle beschreven stappen zijn minimaal invasief en maken live-analyses op lange termijn mogelijk. De hier beschreven methoden kunnen eenvoudig worden aangepast en toegepast op andere ontwikkelingsstadia, weefsels of modelorganismen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De orde van de lange afstand is een essentieel kenmerk van de meeste functionele fysiologische eenheden. Tijdens morfogenese wordt de orde bereikt door de integratie van complexe instructies die met hoge temporele en ruimtelijke precisie worden uitgevoerd. Meerdere en multilevel beperkingen zijn geïntegreerd in gestereotypeerde weefsel regelingen.
Polariteit en directionaliteit zijn cruciaal voor de geordende ruimtelijke ordening tijdens de ontwikkeling. Polariteit impliceert symmetrie breken…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen de leden van het laboratorium Martín-Blanco bedanken voor nuttige discussies. We danken ook Nic Tapon (The Crick Institute, Londen, UK), het Bloomington Stock Center (University of Indiana, USA) en FlyBase (voor Drosophila gen annotatie). Federica Mangione werd ondersteund door een JAE-CSIC predoctorale fellowship. Het Laboratorium Martín-Blanco werd gefinancierd uit het Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P en BFU2017-82876-P) en van de Fundación Ramón Areces.
Materials
| Analysis Software | – | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | – | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | – | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae. Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).
- Stell, W. K. The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus. Comparative Biochemistry and Physiology – Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336, 724-727 (2012).
- Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
- Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium. Development. 144, 95-105 (2017).
- Weavers, H., et al. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).
- Mangione, F., Martin-Blanco, E. The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen. Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).
- Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. Developmental compartments and planar polarity in Drosophila. Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).
- Wootton, R. How flies fly. Nature. 400, 112-113 (1999).
- Zallen, J. A., Wieschaus, E. Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila. Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).
- Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux’s archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).
- Kornberg, T. Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus. Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).
- Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. Clonal parameters of tergite development in Drosophila. Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).
- Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux’s archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).
- Madhavan, M. M., Madhavan, K. Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40, 2552-2556 (2009).
- Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).
- Hammer, &. #. 2. 1. 6. ;., Harper, D. A., Ryan, P. D. PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).
- Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity. Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).
- Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity. Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).
- Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension. Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).
- Martin-Blanco, E., et al. puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila. Genes and Development. 12, 557-570 (1998).
- Dye, N. A., et al. Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144, 4406-4421 (2017).
- Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis. Development. 124, 2889-2901 (1997).
- Ferguson, M. W. Palate development. Development. 103, 41-60 (1988).
