Imagerie et analyse de l’orientation tissulaire et de la dynamique de croissance dans l’épithélie de drosophile en développement pendant les stades pupal
Summary
Ce protocole est conçu pour l’imagerie et l’analyse de la dynamique de l’orientation cellulaire et de la croissance des tissus dans l’épithélie abdominale Drosophila que la mouche des fruits subit une métamorphose. La méthodologie décrite ici peut être appliquée à l’étude de différents stades de développement, tissus et structures subcellulaires dans Drosophila ou d’autres organismes modèles.
Abstract
Dans les organismes multicellulaires, les tissus et les organes matures affichent des degrés élevés d’ordre dans les arrangements spatiaux de leurs cellules constitutives. Un exemple remarquable est donné par l’épithélia sensorielle, où les cellules des mêmes identités ou distinctes sont réunies par l’adhérence cellulaire montrant des modèles planaires très organisés. Les cellules s’alignent les unes sur les autres dans la même direction et affichent une polarité équivalente sur de grandes distances. Cette organisation de l’épithélia mature est établie au cours de la morphogenèse. Pour comprendre comment l’arrangement planaire de l’épithélia mature est atteint, il est crucial de suivre l’orientation cellulaire et la dynamique de croissance avec une fidélité spatiotemporal élevée pendant le développement in vivo. Des outils d’analyse robustes sont également essentiels pour identifier et caractériser les transitions locales à mondiales. La pupe Drosophila est un système idéal pour évaluer les changements orientés de forme cellulaire sous-jacents morphogenèse épithéliale. L’épithélium en développement du pupal constitue la surface externe du corps immobile, permettant l’imagerie à long terme des animaux intacts. Le protocole décrit ici est conçu pour imager et analyser les comportements cellulaires aux niveaux mondial et local dans l’épiderme abdominal pupal à mesure qu’il grandit. La méthodologie décrite peut être facilement adaptée à l’imagerie des comportements cellulaires à d’autres stades de développement, tissus, structures subcellulaires, ou organismes modèles.
Introduction
Pour atteindre leurs rôles, les tissus épithéliaux s’appuient pleinement sur l’organisation spatiale de leurs composants cellulaires. Dans la plupart des épithéliales, les cellules sont non seulement emballées les unes contre les autres pour créer une couche pavée précise, mais elles s’orientent par rapport aux axes du corps.
L’importance fonctionnelle de l’organisation précise des tissus est évidente dans l’épithélia sensorielle, comme l’oreille interne vertébré et la rétine. Dans le premier cas, les cheveux et les cellules de soutien s’alignent dans une direction axial spécifique pour détecter efficacement les entrées mécaniques telles que le son et le mouvement1,2. De même, l’organisation spatiale des cellules photoréceptrices est essentielle pour atteindre des propriétés optiques optimales par la rétine3. Le contrôle spatial de la position et de l’orientation cellulaires est donc d’une pertinence particulière pour une fonction physiologique appropriée.
Drosophila est un insecte holometabolous qui subit une transformation complète de ses structures corporelles larvaires par métamorphose, donnant naissance à ses tissus adultes. La pupe Drosophila est un excellent modèle pour l’imagerie en direct non invasive d’une variété d’événements dynamiques, y compris la migration des cellules développementales4, la division cellulaire et la dynamique de croissance5, contraction musculaire6, la mort cellulaire7, la réparation de la plaie8, et l’orientation cellulaire9. Dans l’adulte Drosophila, l’épithélium externe montre un haut degré d’ordre. Ceci est facilement observé sur les arrangements des trichomes (c.-à-d. les protubérances cellulaires provenant de cellules épithéliales simples) et les poils sensoriels sur toute la surface du corps de la mouche10. En effet, les trichomes sont alignés dans des rangées parallèles guidant le flux d’air11. La morphogénèse de l’épithélie adulte et l’arrangement ordonné des cellules individuelles commence pendant l’embryogenèse et culminent pendant les stades pupal. Alors que dans les divisions cellulaires des embryons, les intercalations, et les changements de forme tous diminuer l’ordre des tissus12,13, cela est retourné à des stades ultérieurs de développement, en particulier à des stades pupal, lorsque la mouche approche de la maturité9.
La pupe immobile Drosophila fournit un système idéal pour évaluer la forme cellulaire et les changements d’orientation. L’épiderme abdominal pupal présente des avantages spéciaux. Tandis que les précurseurs de la tête, du thorax, des organes génitaux et des appendices adultes se développent et obtiennent modelés à partir des stades larvaires, les histoblastes, qui sont intégrés dans l’épiderme larvaire, commencent à croître et à se différencier seulement à la pupariation14. Cette fonctionnalité permet le suivi de tous les événements spatiotemporal impliqués dans l’établissement de l’ordre tissulaire dans son intégralité9.
Les histoblastes sont spécifiés pendant le développement embryonnaire aux positions contralatérales dans chaque segment abdominal présumé. L’épiderme abdominal dorsale de l’adulte dérive des nids d’histoblaste situés de façon dorsolaterale présent dans les compartiments antérieurs et postérieurs15,16. Au fur et à mesure que les histoblastes se développent, remplaçant les cellules épithéliales larvaires (LEC), les nids contralatéraux fusionnent à la ligne médiane dorsale formant une feuille confluente17,18,19,20.
Ce travail décrit 1) une méthodologie pour la dissection, le montage, et l’imagerie vivante à long terme de la pupe de Drosophila, et 2) méthodes analytiques pour étudier la dynamique de l’orientation et de la croissance cellulaires à la résolution spatiotemporal élevée. Un protocole détaillé est fourni ici, couvrant toutes les étapes requises depuis la préparation initiale des pupes (c.-à-d. la mise en scène et l’imagerie) jusqu’à l’extraction et la quantification des caractéristiques de directionnalité et d’orientation. Nous décrivons également comment déduire les propriétés tissulaires locales de l’analyse des clones cellulaires. Toutes les étapes décrites sont peu invasives et permettent des analyses en direct à long terme. Les méthodes décrites ici peuvent être facilement adaptées et appliquées à d’autres stades de développement, tissus ou organismes modèles.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ordre à longue portée est une caractéristique essentielle de la plupart des unités physiologiques fonctionnelles. Pendant la morphogenèse, l’ordre est atteint grâce à l’intégration d’instructions complexes mises en œuvre avec une grande précision temporelle et spatiale. Les contraintes multiples et multiniveau sont intégrées dans les arrangements tissulaires stéréotypés.
La polarité et la directionnalité sont essentielles à l’arrangement spatial ordonné pendant l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Martin-Blanco pour des discussions utiles. Nous remercions également Nic Tapon (The Crick Institute, Londres, Royaume-Uni), le Bloomington Stock Center (Université de l’Indiana, Etats-Unis) et FlyBase (pour l’annotation des gènes Drosophila). Federica Mangione a été soutenue par une bourse prédoctorale JAE-CSIC. Le laboratoire Martin-Blanco a été financé par la Programa Estatal de Fomento de la Investigacion Cient-fica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P et BFU2017-82876-P) et de la Fondation Ramon Ramon Areces.
Materials
| Analysis Software | – | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | – | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | – | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae. Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).
- Stell, W. K. The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus. Comparative Biochemistry and Physiology – Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336, 724-727 (2012).
- Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
- Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium. Development. 144, 95-105 (2017).
- Weavers, H., et al. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).
- Mangione, F., Martin-Blanco, E. The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen. Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).
- Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. Developmental compartments and planar polarity in Drosophila. Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).
- Wootton, R. How flies fly. Nature. 400, 112-113 (1999).
- Zallen, J. A., Wieschaus, E. Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila. Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).
- Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux’s archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).
- Kornberg, T. Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus. Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).
- Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. Clonal parameters of tergite development in Drosophila. Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).
- Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux’s archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).
- Madhavan, M. M., Madhavan, K. Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40, 2552-2556 (2009).
- Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).
- Hammer, &. #. 2. 1. 6. ;., Harper, D. A., Ryan, P. D. PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).
- Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity. Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).
- Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity. Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).
- Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension. Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).
- Martin-Blanco, E., et al. puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila. Genes and Development. 12, 557-570 (1998).
- Dye, N. A., et al. Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144, 4406-4421 (2017).
- Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis. Development. 124, 2889-2901 (1997).
- Ferguson, M. W. Palate development. Development. 103, 41-60 (1988).
