Embriyonik Greftleme Yoluyla Mutant Haploid Ekstremiteler ile Şemerik Axolotls Üretimi
Summary
Bu protokolün amacı, embriyonik doku aşılama teknikleri kullanılarak Cas9-mutajenize donör dokusundan elde edilen haploid forelimbs ile şimerik axolotls üretmektir.
Abstract
Genetik teknikler ve kaynaklar büyüyen bir dizi araştırmacılar semender bazı türlerin moleküler kökenleri araştırmak için izin, aksitolar gibi, yetişkin olarak tüm uzuvları yeniden. Burada, gen fonksiyonunu ve ekstremite rejenerasyonunun sadakatini keşfetmek için kullanılabilecek Cas9-mutajenizeize haploid forelimbs ile şimerik axolotls oluşturmak için kullanılan teknikleri anahat. İn vitro aktivasyon yoluyla haploid üretimi, CRISPR/Cas9 mutagenezi ve doku greftleme gibi çeşitli embriyolojik ve genetik teknikleri birleştirerek yenilenmenin model organizmasında haploid genetik tarama için benzersiz bir sistem üretiyoruz. Bu strateji, ekstremite rejenerasyonundaki genlerin fonksiyonel analizi için gerekli olan hayvan, alan ve zaman sayısını azaltır. Bu aynı zamanda organogenez, doku morfogenezi ve diğer temel embriyonik süreçler gibi diğer temel süreçler için gerekli olabilecek genlerin rejenerasyona özgü fonksiyonlarının araştırılmasına izin verir. Burada açıklanan yöntem bir omurgalı model sisteminde haploid genetik tarama yapmak için benzersiz bir platformdur.
Introduction
Tarihsel olarak, amfibiler embriyonik doku greftleme gelişim biyolojisi ve rejenerasyon temel mekanizmaları keşfetmek için önemli bir teknik olmuştur. Semender bir tür olan aksolotl, yaralanma veya ampütasyon dan sonra dokuları ve uzuvlar ve organlar gibi karmaşık yapıları yenilemek için etkileyici bir yeteneğe sahiptir. Benzer şekilde etkileyici, onlar alabilirsiniz, reddi olmadan, embriyonik diğer bireylerden doku greftleri, juvenil, ve yetişkin aşamaları1,2,3. Uzuvlar, kuyruklar, gözler ve kafalar gibi bütün yapıları üreten embriyo bölgeleri ve nöroektoderm ve somitler gibi daha spesifik dokular, şeymerik hayvanlar üretmek için embriyolar arasında aşılanabilir1,2,4,5,6. Yaklaşık bir yüzyıl boyunca, bu tür şemerik hayvanların çalışmaları rejenerasyon içine önemli anlayışlar sağlamıştır, doku farklılaşması, boyut kontrolü, ve desenleme1,7,8.
Son on yılda, dokuların çok sayıda transkripsiyonel çalışmalar salamander rejenerasyon9,10,11,12,13altında yatan genetik programlar içine anlayışlar üretti . Bu çalışmalar, bugüne kadar, büyük ölçüde rejenerasyon bağlamında karakterize edilmeyen aday genlerin genişleyen bir listeye ekledik. CRISPR / Cas gibi Hedefmutage teknikleri, şimdi bu tür genlerin araştırılmasına izin, ve bu tür genetik yaklaşımlar büyük ölçüde son sıralama ve büyük axolotl genom14,15,16montaj tarafından kolaylaştırılır .
Klasik gelişim biyolojisini yeni genetik teknolojiyle birleştirerek yenilenme mekanizmalarını incelemek amacıyla teknikler geliştirmeye çalıştık. Axolotls ve diğer semenderler haploid embriyolar oluşturmak için yöntemler on yıllardır kurulmuştur17. Bu teknikler uzun genetik model organizmalar olarak semenderlerin avantajları olduğu belirtilmiştiriken 18, birkaç sonraki genetik çalışmalar haploid hayvanlar dahil var. Biz19aşılama için doku donör olarak hizmet haploid embriyolar üretmek için axolotl in vitro aktivasyon kullanın. Floresan genetik belirteçler taşıyan embriyolar kullanarak, neredeyse tamamen donör dokulardan elde edilen uzuvlar üretmek için güvenilir yöntemler tasarladık(Şekil 1A). Bu iki tekniği birleştirerek, haploidile ilişkili geç embriyonik öldürücülüğü atladık, tam gelişmiş, aşılı haploid ekstremitelerin üretimine izin verdik (Şekil 1B, Şekil 1B’ve Şekil 2).
Mutant haploid ekstremiteler ile şimerik aksokolotls oluşturmak için aşılama dan önce haploid embriyolarda CRISPR/Cas aracılı mutagenez yaparak, özellikle ekstremite gelişimi ve rejenerasyonu bağlamında gen fonksiyonlarını inceleyebiliriz. Bu potansiyel embriyonik öldürücü mutant fenotiplerden uzuvların kurtarılmasını sağlar. CRISPR / Cas mikroenjeksiyon son derece mutant hayvanlar üretebilir iken, bu tür hayvanlar genellikle son derece mozaik, yabani tür alel tutma bir dereceye kadar ve hedeflenen sitelerde farklı mutasyonlar çeşitli14,20. Haploid hücrelerde CRISPR tabanlı mutagenez, tutulan yabani tip aleller tarafından maskelenemedikleri için tek alel kaybı-fonksiyon mutasyonlarının penetrasyonunu artırır. Bu nedenle, haploid hücre hatlarında CRISPR tabanlı tarama giderek birçok hücresel süreçlerin genetik temelini araştırmak için kullanılır21,22,23. Bizim haploid ekstremite tomurcuk aşılama protokolleri ile CRISPR tabanlı soy izleme birleştirerek, burada açıklanan yaklaşım canlı hayvanlarda haploid genetik ekranlar için bir platform olarak hizmet verebilir20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Haploid-diploid kimeralar üretmek için protokolümüzde, işletme teknisyeninin tutarlı aşılama sonuçları için göz önünde bulundurması gereken birkaç kritik adım vardır.
Haploid neslin başarısız olmasının en olası nedeni in vitro aktivasyon koşullarının zayıf olmasıdır. Hareketli sperm uygun miktarlarda yumurta etkinleştirmek için kullanılmalıdır. Hareketliliği uzatmak için sperm örnekleri her zaman 4 °C’de muhafaza edilmelidir. Yumurtalara herhangi bir sper…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Katherine Roberts’a axolotl kolonisine baktığı için teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışmanın finansmanı Connecticut Innovations Rejeneratif Tıp Araştırma Fonu (15RMA-YALE-09 ve 15-RMB-YALE-01) ve Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü (Bireysel Doktora Sonrası Burs F32HD086942).
Materials
| #55 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11295-1 | Only use Dumostar material (can be autoclaved) |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | 20 mL |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400 (polysucrose 400) | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1914-250MG | |
| Heating/Cooling Incubator | RevSci | RS-IF-233 | |
| Human Chorionic Gonadotropin | Merk | Chorulon | |
| Megascript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher | AM1334 | 40 reactions |
| Miroscope Cooling Stage | Brook Industries | Custom | Custom |
| NLS Cas9 Protein | PNAbio | CP01-200 | 4 vials of 50 µg protein each |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | Treatment level |
| Recipes | |||
| 1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) | 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4 | ||
| 40% Holtfreter's solution | 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4 |
References
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
- McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).
- Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
- Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
- de Both, N. J. Transplantation of Axolotl Heads. Science. 162 (3852), 460-461 (1968).
- Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
- Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
- Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
- Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352 (2013).
- Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
- Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548 (2018).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
- Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
- Malacinski, G. M., Brothers, A. J. Mutant Genes in the Mexican Axolotl. Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).
- Armstrong, B. Gynogenesis in the mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
- Shalem, O., et al. Genome – scale CRISPR – Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
- Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
- Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Kumar, A., Simon, A. . Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , (2015).
- Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
- Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).
- Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
- Fei, J. -. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).
