جيل من الأناكسولوت الشيميري مع أطراف هابلويد متحولة من خلال التطعيم الجنيني

تاريخيا، كان تطعيم الأنسجة الجنينية في البرمائيات تقنية هامة لاستكشاف الآليات الأساسية لبيولوجيا النمو والتجدد. يمتلك الأكسولوتل، وهو نوع من السلمندر، قدرة مثيرة للإعجاب على تجديد الأنسجة والهياكل المعقدة مثل الأطراف والأعضاء بعد الإصابة أو البتر. وبالمثل، فإنها يمكن أن تتلقى، دون رفض، ترقيع الأنسجة من أفراد آخرين في مراحل الجنين، والأحداث، والكبار^1،2،3. مناطق الأجنة التي تنتج هياكل كاملة مثل الأطراف والذيول والعينين والرؤوس ، والأنسجة الأكثر تحديدًا ، مثل neuroectoderm والسوميتس ، يمكن تطعيمها بين الأجنة لإنتاج الحيوانات الشيمية^{1،2،4،5،6.} على مدى ما يقرب من قرن من الزمان ، قدمت دراسات مثل هذه الحيوانات الوهمية رؤى حاسمة في التجديد ، وتمايز الأنسجة ، والتحكم في الحجم ، ونمط^1،7،8.

في العقد الماضي ، أنتجت العديد من الدراسات النسخة من الأنسجة التجدد رؤى في البرامج الوراثية الكامنة وراء تجديد السلمندر^{9،10،11،12،13.} وقد أضافت هذه الدراسات إلى قائمة موسعة من الجينات المرشحة التي، حتى الآن، غير قابلة للتوصيف إلى حد كبير في سياق التجديد. تقنيات الطفرات المستهدفة ، مثل CRISPR / Cas ، تسمح الآن بالتحقيق في مثل هذه الجينات ، ويتم تسهيل هذه النهج الجينية إلى حد كبير من خلال التسلسل والتجميع الأخير لجينوم axolotl الكبير^14،15،16.

سعينا لتطوير التقنيات التي قرنت البيولوجيا التنموية الكلاسيكية مع التكنولوجيا الوراثية الجديدة لغرض تشريح آليات التجديد. وقد وضعت أساليب لتوليد الأجنة haploid من axolotls وغيرها من السلمندر لعقود^17. في حين أن هذه التقنيات قد لوحظ منذ فترة طويلة لتكون مزايا السلمندر ككائنات النموذج الجيني¹⁸، إلا أن الدراسات الجينية اللاحقة قليلة أدرجت الحيوانات الهابلويد. نحن نستخدم في تنشيط المختبر في axolotl لإنتاج الأجنة haploid التي تعمل كمتبرعين الأنسجة لتطعيم^19. باستخدام الأجنة التي تحمل علامات وراثية فلورية ، ابتكرنا طرقًا موثوقة لتوليد الأطراف المشتقة بالكامل تقريبًا من أنسجة المتبرعين(الشكل 1A). من خلال الجمع بين هاتين التقنيتين ، تجاوزنا الفتك الجنيني المتأخر المرتبط بالهابلويد ، مما يسمح بإنتاج أطراف هابلويد مطورة تمامًا والمطعمة(الشكل 1B، الشكل 1B“، والشكل 2).

من خلال إجراء CRISPR / Cas بوساطة الطفرات في الأجنة haploid قبل التطعيم لإنشاء axolotls الوهمي مع أطرافها هابلويد متحولة ، قد نحقق في وظيفة الجينات على وجه التحديد في سياق تطور الأطراف وتجديدها. وهذا يسمح بإنقاذ الأطراف من الأنماط الظاهرية المتحولة الجنينية المحتملة. في حين يمكن أن تولد CRISPR / Cas microinjection الحيوانات التي هي متحولة للغاية ، فإن هذه الحيوانات عادة ما تكون فسيفساء عالية ، مع درجة ما من الاحتفاظ بأليلات النمط البري ومجموعة متنوعة من الطفرات المتميزة في المواقع المستهدفة^14،20. CRISPR القائم على الطفرات في خلايا haploid يزيد من penetrance واحد أليل فقدان وظيفة الطفرات، كما أنها لا يمكن أن تكون ملثمين من قبل alleles البرية المحتفظ بها. لهذا السبب ، يتم استخدام الفحص القائم على CRISPR في خطوط الخلايا haploid بشكل متزايد للتحقيق في الأساس الوراثي للعديد من العمليات الخلوية^21،22،23. من خلال الجمع بين تتبع النسب CRISPR المستندة إلى بروتوكولات تطعيم برعم الأطراف haploid ، يمكن للنهج الموصوف هنا أن يكون بمثابة منصة للشاشات الوراثية haploid في الحيوانات الحية^20.