Geração de Axolotis Quiméricos com Membros Haploides Mutantes através de enxerto embrionário
Summary
Este objetivo deste protocolo é produzir axolotos quiméricos com membros dianteiros haploides derivados de tecido doador mutagenizado de Cas9 usando técnicas de enxerto de tecido embrionário.
Abstract
Um conjunto crescente de técnicas e recursos genéticos permite aos pesquisadores sondar as origens moleculares da capacidade de algumas espécies de salamandras, como axolotlas, de regenerar membros inteiros como adultos. Aqui, delineamos técnicas usadas para gerar axolotas quiméricas com membros dianteiros haploides haploides mutagenizados cas9 que podem ser usados para explorar a função genética e a fidelidade da regeneração dos membros. Combinamos várias técnicas embrionárias e genéticas, incluindo geração haploide via ativação in vitro, mutagênese CRISPR/Cas9 e enxerto de tecido em um protocolo para produzir um sistema único para triagem genética haploide em um organismo modelo de regeneração. Essa estratégia reduz o número de animais, espaço e tempo necessários para a análise funcional dos genes na regeneração dos membros. Isso também permite a investigação de funções específicas de regeneração de genes que podem ser necessárias para outros processos essenciais, como organogênese, morfose tecidual e outros processos embrionários essenciais. O método descrito aqui é uma plataforma única para a realização de triagem genética haploide em um sistema de modelo vertebrado.
Introduction
Historicamente, o enxerto de tecido embrionário em anfíbios tem sido uma técnica importante para explorar mecanismos fundamentais de biologia e regeneração do desenvolvimento. O axolotl, uma espécie de salamandra, possui uma impressionante capacidade de regenerar tecidos e estruturas complexas, como membros e órgãos após lesões ou amputação. Da mesma forma impressionante, eles podem receber, sem rejeição, enxertos teciduais de outros indivíduos nos estágios embrionário, juvenil e adulto1,2,3. Regiões de embriões que produzem estruturas inteiras como membros, caudas, olhos e cabeças, e tecidos mais específicos, como neuroectoderme e somitas, podem ser enxertados entre embriões para produzir animais quiméricos1,2,4,5,6. Por quase um século, estudos desses animais quiméricos têm proporcionado insights cruciais sobre regeneração, diferenciação tecidual, controle de tamanho e padronização1,7,8.
Na última década, inúmeros estudos transcricionais de tecidos regeneradores produziram insights sobre os programas genéticos subjacentes à regeneração da salamandra9,10,11,12,13. Esses estudos se somaram a uma lista crescente de genes candidatos que, até o momento, são em grande parte descaracterizados no contexto da regeneração. Técnicas de mutagênese direcionadas, como crispr/cas, agora permitem a investigação de tais genes, e tais abordagens genéticas são muito facilitadas pelo sequenciamento recente e montagem do grande genoma axolotl14,15,16.
Buscamos desenvolver técnicas que acoplassem biologia clássica ao desenvolvimento com novas tecnologias genéticas com o objetivo de dissecar os mecanismos de regeneração. Métodos para gerar embriões haploides de axolotis e outros salamandras foram estabelecidos há décadas17. Embora essas técnicas tenham sido apontadas há muito tempo como vantagens dos salamandras como organismos modelo genéticos18, poucos estudos genéticos subsequentes incorporaram animais haploides. Usamos ativação in vitro no axolotl para produzir embriões haploides que servem como doadores de tecidos para enxerto19. Usando embriões que carregam marcadores genéticos fluorescentes, criamos métodos confiáveis para gerar membros derivados quase inteiramente de tecidos doadores(Figura 1A). Ao combinar essas duas técnicas, contornamos a letalidade embrionária tardia associada à haploide, permitindo a produção de membros heplóides totalmente desenvolvidos e enxertados(Figura1B, Figura 1Be Figura 2).
Ao conduzir a mutagênese mediada crispr/cas em embriões haploides antes do enxerto para criar axolotos quiméricos com membros haploides mutantes, podemos investigar a função genética especificamente dentro do contexto de desenvolvimento e regeneração dos membros. Isso permite o resgate de membros de fenótipos mutantes potencialmente embrionários-letais. Enquanto a microinjeção CRISPR/Cas pode gerar animais altamente mutantes, esses animais são tipicamente altamente mosaicos, com algum grau de retenção de alelos de tipo selvagem e uma variedade de mutações distintas em locais alvo14,20. A mutagênese à base de CRISPR em células haploides aumenta a penetração de mutações de perda de função de alelo único, pois não podem ser mascaradas por alelos do tipo selvagem retidos. Por essa razão, o rastreamento à base de CRISPR em linhas de células haploides é cada vez mais usado para investigar a base genética de muitos processos celulares21,22,23. Combinando rastreamento de linhagem à base de CRISPR com nossos protocolos de enxerto de bud alheio haploide, a abordagem descrita aqui pode servir como uma plataforma para telas genéticas haploides em animais vivos20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem alguns passos críticos em nosso protocolo para gerar quimeras haplóide-ddiploide que o técnico operacional deve considerar para resultados consistentes de enxerto.
A razão mais provável para a geração haploide falhar é devido às más condições de ativação in vitro. As quantidades adequadas de espermatozoides motile devem ser usadas para ativar óvulos. Para prolongar a motilidade, as amostras de esperma devem ser sempre mantidas a 4 °C. Antes de aplicar qualquer amostra d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Katherine Roberts por seus cuidados com a colônia de axolotl. O financiamento para este trabalho foi fornecido pelo Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 e 15-RMB-YALE-01) e pelo Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano Eunice Kennedy Shriver (Pós-Doutorado Individual Bolsa F32HD086942).
Materials
| #55 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11295-1 | Only use Dumostar material (can be autoclaved) |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | 20 mL |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400 (polysucrose 400) | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1914-250MG | |
| Heating/Cooling Incubator | RevSci | RS-IF-233 | |
| Human Chorionic Gonadotropin | Merk | Chorulon | |
| Megascript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher | AM1334 | 40 reactions |
| Miroscope Cooling Stage | Brook Industries | Custom | Custom |
| NLS Cas9 Protein | PNAbio | CP01-200 | 4 vials of 50 µg protein each |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | Treatment level |
| Recipes | |||
| 1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) | 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4 | ||
| 40% Holtfreter's solution | 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4 |
References
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
- McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).
- Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
- Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
- de Both, N. J. Transplantation of Axolotl Heads. Science. 162 (3852), 460-461 (1968).
- Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
- Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
- Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
- Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352 (2013).
- Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
- Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548 (2018).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
- Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
- Malacinski, G. M., Brothers, A. J. Mutant Genes in the Mexican Axolotl. Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).
- Armstrong, B. Gynogenesis in the mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
- Shalem, O., et al. Genome – scale CRISPR – Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
- Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
- Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Kumar, A., Simon, A. . Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , (2015).
- Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
- Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).
- Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
- Fei, J. -. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).
