Generation von Chimeric Axolotls mit Mutant Haploid Limbs Durch Embryonale Grafting

Historisch gesehen war die embryonale Gewebetransplantation in Amphibien eine wichtige Technik zur Erforschung grundlegender Mechanismen der Entwicklungsbiologie und Regeneration. Das Axolotl, eine Salamanderart, besitzt eine beeindruckende Fähigkeit, Gewebe und komplexe Strukturen wie Gliedmaßen und Organe nach Verletzungen oder Amputationen zu regenerieren. Ebenso beeindruckend können sie ohne Abstoßung Gewebetransplantate von anderen Individuen in embryonalen, juvenilen und erwachsenen Stadien^1,2,3erhalten. Regionen von Embryonen, die ganze Strukturen wie Gliedmaßen, Schwänze, Augen und Köpfe produzieren, und spezifischere Gewebe, wie Neuroektoderm und Soden, können zwischen Embryonen gepfropft werden, um chimäre Tiere zu produzieren^1,2,4,5,6. Seit fast einem Jahrhundert liefern Studien an solchen chimertieren den entscheidenden Einblicken in Regeneration, Gewebedifferenzierung, Größenkontrolle und Musterung^1,7,8.

In den letzten zehn Jahren haben zahlreiche transkriptionelle Studien an regenerierenden Geweben Einblicke in die genetischen Programme der Salamanderregeneration^{9,10,11,12,13}. Diese Studien haben zu einer wachsenden Liste von Kandidatengenen hinzugefügt, die bis heute im Kontext der Regeneration weitgehend uncharakterisiert sind. Gezielte Mutagenesetechniken wie CRISPR/Cas ermöglichen nun die Untersuchung solcher Gene, und solche genetischen Ansätze werden durch die kürzliche Sequenzierung und Montage des großen Axolotl-Genoms^14,15,16erheblich erleichtert.

Wir versuchten, Techniken zu entwickeln, die klassische Entwicklungsbiologie mit neuer Gentechnologie koppelten, um die Mechanismen der Regeneration zu sezieren. Methoden zur Erzeugung haploider Embryonen von Axolotls und anderen Salamandern sind seit Jahrzehnten etabliert¹⁷. Während diese Techniken seit langem als Vorteile von Salamandern als genetische Modellorganismen¹⁸bezeichnet werden, haben nur wenige nachfolgende genetische Studien haploide Tiere aufgenommen. Wir verwenden In-vitro-Aktivierung im Axolotl, um haploide Embryonen zu produzieren, die als Gewebespender für die Transplantation dienen¹⁹. Mit Embryonen, die fluoreszierende genetische Marker tragen, haben wir zuverlässige Methoden zur Erzeugung von Gliedmaßen entwickelt, die fast ausschließlich aus Spendergeweben gewonnen wurden (Abbildung 1A). Durch die Kombination dieser beiden Techniken haben wir die späte embryonale Letalität im Zusammenhang mit der Haploidie umgangen, die die Produktion voll entwickelter, transplantierter haploider Gliedmaßen ermöglicht (Abbildung 1B, Abbildung 1B”und Abbildung 2).

Durch die Durchführung von CRISPR/Cas-vermittelter Mutagenese in haploiden Embryonen vor der Transplantation zur Herstellung von chimerischen Axolotlen mit mutierten haploiden Gliedmaßen können wir die Genfunktion speziell im Kontext der Gliedmaßenentwicklung und -regeneration untersuchen. Dies ermöglicht die Rettung von Gliedmaßen von potenziell embryonal-tödlichen mutierten Phänotypen. Während CRISPR/Cas Mikroinjektion Tiere erzeugen kann, die stark mutiert sind, sind solche Tiere in der Regel sehr mosaikartig, mit einem gewissen Grad an Retention von Wildtyp-Allelen und einer Vielzahl von unterschiedlichen Mutationen an den Zielstellen^14,20. CRISPR-basierte Mutagenese in haploiden Zellen erhöht die Penetranz einzelner Allelverlust-der-Funktionsmutationen, da sie nicht durch zurückgehaltene Wildtyp-Allele maskiert werden können. Aus diesem Grund wird DAS CRISPR-basierte Screening in haploiden Zelllinien zunehmend zur Untersuchung der genetischen Grundlagen vieler zellulärer Prozesse^21,22,23verwendet. Durch die Kombination von CRISPR-basierter Linienverfolgung mit unseren haploiden Gliedmaßenknospen-Pfropfprotokollen kann der hier beschriebene Ansatz als Plattform für haploide genetische Screens bei lebenden Tieren dienen²⁰.