Поколение химерных актолотлов с мутантными гаплоидными конечностями через эмбриональную прививку
Summary
Эта цель этого протокола состоит в том, чтобы производить химерные акколоты с гаплоидными передними конечностями, полученными из Cas9-мутагенизированной донорской ткани с использованием методов прививки эмбриональной ткани.
Abstract
Растущий набор генетических методов и ресурсов позволяет исследователям исследовать молекулярное происхождение способности некоторых видов саламандры, таких как аксолотлы, регенерировать целые конечности во взрослом возрасте. Здесь мы намечаем методы, используемые для генерации химерных актолотлов с Cas9-мутагенизированными гаплоидными передними конечностями, которые могут быть использованы для изучения функции гена и верности регенерации конечностей. Мы объединяем несколько эмбриологических и генетических методов, включая гаплоидное поколение с помощью активации in vitro, мутагенеза CRISPR/Cas9 и прививание тканей в один протокол для создания уникальной системы гаплоидного генетического скрининга в модельном организме регенерации. Эта стратегия сокращает количество животных, пространство и время, необходимое для функционального анализа генов в регенерации конечностей. Это также позволяет исследует регенерационные функции генов, которые могут потребоваться для других важных процессов, таких как органогенез, морфогенез тканей и другие важные эмбриональные процессы. Описанный здесь метод является уникальной платформой для проведения гаплоидного генетического скрининга в системе позвоночных.
Introduction
Исторически сложилось так, что прививка эмбриональной ткани амфибий была важным методом для изучения фундаментальных механизмов биологии развития и регенерации. Аксолотль, вид саламандры, обладает впечатляющей способностью к регенерации тканей и сложных структур, таких как конечности и органы после травмы или ампутации. Аналогичным образом впечатляюще, они могут получать, без отторжения, ткани трансплантатов от других лиц на эмбриональных, юношеских и взрослых стадиях1,2,3. Регионы эмбрионов, которые производят целые структуры, такие как конечности, хвосты, глаза и головы, и более конкретные ткани, такие как нейроэктодерм и сомиты, могут быть привиты между эмбрионами для производства химерных животных1,2,4,6. На протяжении почти столетия, исследования таких химерных животных предоставили решающее понимание регенерации, дифференциации тканей, контроля размера, и узор1,7,8.
В последнее десятилетие, многочисленные транскрипционные исследования регенерирующих тканей дали понимание генетических программ, лежащих в основе регенерации саламандры9,10,11,12,13. Эти исследования добавили к расширяющемуся списку генов-кандидатов, которые на сегодняшний день в значительной степени не характерны в контексте регенерации. Целевые методы мутагенеза, такие как CRISPR/ Cas, теперь позволяют исследуют такие гены, и такие генетические подходы в значительной степени облегчаются недавним секвенированием и сборкой большого аксолотла генома14,15,16.
Мы стремились разработать методы, которые соединяли классическую биологию развития с новой генетической технологией с целью вскрытия механизмов регенерации. Методы генерации гаплоидных эмбрионов аксолотлов и других саламандр были созданы на протяжениидесятилетий 17. Хотя эти методы уже давно отмечается, что преимущества саламандры, как генетическая модель организмов18, несколько последующих генетических исследований включили гаплоидных животных. Мы используем интроактивации в аксолотле для производства гаплоидных эмбрионов, которые служат донорами тканей для прививки19. Используя эмбрионы, несущие флуоресцентные генетические маркеры, мы разработали надежные методы генерации конечностей, полученных почти полностью из донорских тканей(рисунок 1А). Объединив эти два метода, мы обошли поздней эмбриональной летальности, связанной с гаплоидией, что позволяет для производства полностью развитых, привитых гаплоидных конечностей(Рисунок 1B, Рисунок 1B‘, и Рисунок 2).
Проводя CRISPR/Cas-опосредованный мутагенез в гаплоидных эмбрионах до прививки для создания химерных аксолотлов с мутантными гаплоидными конечностями, мы можем исследовать функцию генов конкретно в контексте развития конечностей и регенерации. Это позволяет спасать конечности от потенциально эмбрионально-смертельных фенотипов мутантов. Хотя CRISPR / Cas микроинъекции может генерировать животных, которые являются весьма мутант, такие животные, как правило, очень мозаики, с некоторой степенью удержания аллелей дикого типа и различные различные мутации в целевых местах14,20. Мутагенез на основе CRISPR в гаплоидных клетках увеличивает пенетранс одного аллеля потери функции мутаций, так как они не могут быть замаскированы сохраненными аллелями дикого типа. По этой причине скрининг на основе CRISPR в гаплоидных клеточных линиях все чаще используется для исследования генетической основы многих клеточных процессов21,22,23. Объединив CRISPR основе линии отслеживания с нашими гаплоидных протоколов прививки конечностей, подход, описанный здесь может служить платформой для гаплоидных генетических экранов у живых животных20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть несколько важных шагов в нашем протоколе для генерации гаплоидно-диплоидных химер, что операционный техник должен рассмотреть для последовательных результатов прививки.
Наиболее вероятной причиной неудачи гаплоидного поколения является плохое состояние активац…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Кэтрин Робертс за ее заботу о колонии аксолот. Финансирование этой работы было предоставлено Коннектикут Инновации Регенеративной медицины научно-исследовательский фонд (15RMA-YALE-09 и 15-RMB-YALE-01) и Eunice Кеннеди Шрайвер Национальный институт здоровья детей и человеческого развития (Индивидуальный постдокторской Стипендия F32HD086942).
Materials
| #55 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11295-1 | Only use Dumostar material (can be autoclaved) |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | 20 mL |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400 (polysucrose 400) | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1914-250MG | |
| Heating/Cooling Incubator | RevSci | RS-IF-233 | |
| Human Chorionic Gonadotropin | Merk | Chorulon | |
| Megascript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher | AM1334 | 40 reactions |
| Miroscope Cooling Stage | Brook Industries | Custom | Custom |
| NLS Cas9 Protein | PNAbio | CP01-200 | 4 vials of 50 µg protein each |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | Treatment level |
| Recipes | |||
| 1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) | 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4 | ||
| 40% Holtfreter's solution | 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4 |
References
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
- McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).
- Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
- Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
- de Both, N. J. Transplantation of Axolotl Heads. Science. 162 (3852), 460-461 (1968).
- Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
- Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
- Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
- Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352 (2013).
- Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
- Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548 (2018).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
- Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
- Malacinski, G. M., Brothers, A. J. Mutant Genes in the Mexican Axolotl. Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).
- Armstrong, B. Gynogenesis in the mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
- Shalem, O., et al. Genome – scale CRISPR – Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
- Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
- Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Kumar, A., Simon, A. . Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , (2015).
- Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
- Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).
- Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
- Fei, J. -. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).
