Summary

胚移植による変異ハプロイド肢を用いたキメラ・アクセロリトの生成

Published: January 29, 2020
doi:

Summary

このプロトコルのこの目標は、胚組織移植技術を用いてCas9変異型ドナー組織に由来するハプロイド前肢を有するキメラ軸アキロルトを産生することである。

Abstract

遺伝的技術と資源の成長セットは、研究者がアクドロtlsのようないくつかの種のサンショウウオの能力の分子起源を調べ、大人として手足全体を再生することを可能にする。ここでは、遺伝子機能と四肢再生の忠実度を調べるCas9-変異ハプロイド前肢を用いてキメラ軸索を生成する手法を概説します。我々は、インビトロ活性化によるハプロイド生成、CRISPR/Cas9突然変異誘発、および組織移植を含むいくつかの胚学的および遺伝的技術を組み合わせて、再生のモデル生物におけるハプロイド遺伝子スクリーニングのためのユニークなシステムを作り出す。この戦略は、四肢再生における遺伝子の機能解析に必要な動物、空間、時間の数を減らす。これにより、組織形成、組織形態形成、その他の重要な胚プロセスなど、他の重要なプロセスに必要な遺伝子の再生特異的機能の研究も可能になります。ここで説明する方法は、脊椎動物モデル系におけるハプロイド遺伝子スクリーニングを行うためのユニークなプラットフォームである。

Introduction

歴史的に、両生類における胚組織移植は、発生生物学と再生の基本的なメカニズムを探求するための重要な技術であった。サンショウウオの種であるアキソロトルは、怪我や切断後に手足や臓器などの組織や複雑な構造を再生する印象的な能力を持っています。同様に印象的に、それらは、拒絶反応なしに、胚、少年、および成人段階1、2、3で他の個体からの組織移植片受け取ることができる。手足、尾、目、頭部などの全構造を産生する胚の領域、および神経外膜およびsomiteのようなより具体的な組織を、胚間で移植してキメラ動物1、2、4、5、6を産生することができる。ほぼ1世紀の間、このようなキメラ動物の研究は、再生、組織分化、サイズ制御、およびパターニング1、7、8に関する重要な洞察を提供してきました。

過去10年間で、組織再生の多数の転写研究は、サンショウウオ再生9、10、11、12、13の根底にある遺伝的プログラムに関する洞察を生み出した。これらの研究は、現在までに再生の文脈でほとんど特徴がない候補遺伝子の拡大リストに追加されました。CRISPR/Casなどの標的変異生成技術は、現在、そのような遺伝子の調査を可能にし、そのような遺伝的アプローチは、大規模なアキソロトルゲノム14、15、16の最近のシーケンシングおよび組み立てによって大きく促進される。

我々は、再生のメカニズムを解剖することを目的として、古典的な発生生物学と新しい遺伝技術を組み合わせた技術を開発することを模索した。axolotlsおよび他のサンショウウオのハプロイド胚を生成するための方法は、数十年のために確立されています17.これらの技術は、遺伝的モデル生物18としてサンショウウオの利点であることが長い間注目されてきたが、その後の遺伝学的研究はほとんどハプロイド動物を組み込んでいる。アキソロトルのインビトロ活性化を使用して、移植のための組織ドナーとして機能するハプロイド胚を産生する19.蛍光遺伝マーカーを持つ胚を用いて、ドナー組織からほぼ完全に導出される手足を生成するための信頼できる方法を考案しました(図1A)。これら2つの技術を組み合わせることで、ハプロイディに関連する後期胚性致死をバイパスし、完全に発達した移植されたハプロイド四肢の産生を可能にした(図1B、1B’、および図2)。

移植前にハプロイド胚にCRISPR/Cas媒介変異を行い、変異型ハプロイド四肢を有するキメラ軸アキロリトを作り出すことで、特に四肢の発達と再生の文脈における遺伝子機能を調べる。これは潜在的に胚死性変異型から四肢の救助を可能にする。CRISPR/Casマイクロインジェクションは高度に変異した動物を生成することができるが、そのような動物は、通常、野生型対立遺伝子の保持度が高く、標的部位14、20で様々な異なる突然変異を有する。ハプロイド細胞におけるCRISPRベースの突然変異誘発は、単一の対立遺伝子喪失機能突然変異の浸透を増加させる。このため、ハプロイド細胞株におけるCRISPRベースのスクリーニングは、多くの細胞プロセス21、22、23の遺伝的基礎を調査するためにますます使用されている。CRISPRベースの系統トレースとハプロイド四肢芽移植プロトコルを組み合わせることで、ここで説明するアプローチは、生きている動物20のハプロイド遺伝的スクリーンのプラットフォームとして役立つ。

Protocol

このプロトコルで使用される実験手順は、イェール大学の動物のケアと使用委員会(IACUC、2017-10557)によって承認され、脊椎動物の使用を規定するすべての連邦政策とガイドラインに従っていました。すべての動物実験は、イェール大学の施設でアンビストマメキシカーナム(axolotls)で行われました。 1. 胚の胚の生成 1つまたは2つのgfpの親24?…

Representative Results

ハプロイド胚の発達は、その「ハプロイド症候群」表現型29によって二重胚と区別することができる。移植片段階では、ハプロイド胚は、卵黄プラグの前後軸および不完全な囲いに沿って減少した曲率を示す(図3A)。蛍光顕微鏡を使用して、ハプロイド胚が父親由来のGFP発現を確実に含まないようにすることができ?…

Discussion

当社のプロトコルには、操作技術者が一貫したグラフト処理結果を考慮する必要があるハプロイド-二倍体キメラを生成するためのいくつかの重要なステップがあります。

ハプロイド生成が失敗する最も可能性の高い理由は、インビトロ活性化条件が悪いためである。卵子を活性化するために、適切な量の運動精子を使用する必要があります。運動性を延長するために、?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは、アキソロトルコロニーの彼女の世話のためにキャサリン・ロバーツに感謝したいと思います。この研究のための資金は、コネチカット州イノベーション再生医療研究基金(15RMA-YALE-09および15-RMB-YALE-01)とユーニス・ケネディ・シュリバー国立小児保健人間開発研究所(個人博士研究員)によって提供されました。フェローシップF32HD086942)。

Materials

#55 Dumont Forceps Fine Science Tools 11295-1 Only use Dumostar material (can be autoclaved)
Amphotericin B Sigma Aldrich A2942-20ML 20 mL
Antibiotic-Antimycotic 100x Thermo Fisher 15240062
Ciprofloxacin Sigma Aldrich 17850-5G-F
Ficoll 400 (polysucrose 400) bioworld 40600032-3 Ficoll 400
Gentamicin Sigma Aldrich G1914-250MG
Heating/Cooling Incubator RevSci RS-IF-233
Human Chorionic Gonadotropin Merk Chorulon
Megascript T7 Transcription Kit Thermo Fisher AM1334 40 reactions
Miroscope Cooling Stage Brook Industries Custom Custom
NLS Cas9 Protein PNAbio CP01-200 4 vials of 50 µg protein each
Plasmocin Invivogen ant-mpt-1 Treatment level
Recipes
1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4
40% Holtfreter's solution 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4

References

  1. Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
  2. Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
  3. McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).
  4. Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
  5. Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
  6. de Both, N. J. Transplantation of Axolotl Heads. Science. 162 (3852), 460-461 (1968).
  7. Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
  8. Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
  9. Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
  10. Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352 (2013).
  11. Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
  12. Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
  13. Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
  14. Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
  15. Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548 (2018).
  16. Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
  17. Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
  18. Malacinski, G. M., Brothers, A. J. Mutant Genes in the Mexican Axolotl. Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).
  19. Armstrong, B. Gynogenesis in the mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
  20. Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
  21. Shalem, O., et al. Genome – scale CRISPR – Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  22. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  23. Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
  24. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
  25. Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
  26. Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
  27. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
  28. Kumar, A., Simon, A. . Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , (2015).
  29. Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
  30. Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).
  31. Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
  32. Fei, J. -. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).

Play Video

Cite This Article
Sanor, L. D., Flowers, G. P., Crews, C. M. Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting. J. Vis. Exp. (155), e60156, doi:10.3791/60156 (2020).

View Video