Génération d'axolotls chimériques avec des membres haploïdes mutants par le biais de greffeembryonnaire
Summary
Cet objectif de ce protocole est de produire des axolotls chimériques avec des membres antérieurs héloïdes dérivés du tissu donneur cas9-mutagérisé utilisant des techniques embryonnaires de greffe de tissu.
Abstract
Un ensemble croissant de techniques et de ressources génétiques permet aux chercheurs de sonder les origines moléculaires de la capacité de certaines espèces de salamandres, comme les axolotls, à régénérer des membres entiers à l’âge adulte. Ici, nous dénoncons les techniques utilisées pour générer des axolotls chimériques avec des membres antérieurs héloïdes mutagérisés Cas9 qui peuvent être utilisés pour explorer la fonction génique et la fidélité de la régénération des membres. Nous combinons plusieurs techniques embryologiques et génétiques, y compris la génération d’haploïdes par l’activation in vitro, la mutagénèse DE CRISPR/Cas9, et la greffe de tissu dans un protocole pour produire un système unique pour le criblage génétique d’haploid dans un organisme modèle de régénération. Cette stratégie réduit le nombre d’animaux, l’espace et le temps requis pour l’analyse fonctionnelle des gènes dans la régénération des membres. Ceci permet également l’étude des fonctions spécifiques de régénération des gènes qui peuvent être exigées pour d’autres processus essentiels, tels que l’organogenèse, la morphogenèse de tissu, et d’autres processus embryonnaires essentiels. La méthode décrite ici est une plate-forme unique pour effectuer le dépistage génétique des haploïdes dans un système de modèle vertébré.
Introduction
Historiquement, la greffe de tissu embryonnaire chez les amphibiens a été une technique importante pour explorer les mécanismes fondamentaux de la biologie du développement et de la régénération. L’axolotl, une espèce de salamandre, possède une capacité impressionnante à régénérer les tissus et les structures complexes telles que les membres et les organes après une blessure ou une amputation. De même, ils peuvent recevoir, sans rejet, des greffes de tissus d’autres individus aux stades embryonnaires, juvéniles et adultes1,2,3. Les régions d’embryons qui produisent des structures entières telles que les membres, la queue, les yeux et les têtes, et des tissus plus spécifiques, tels que le neuroectoderm et les somites, peuvent être greffés entre les embryons pour produire des animaux chimériques1,2,4,5,6. Pendant près d’un siècle, les études de ces animaux chimériques ont fourni des aperçus cruciaux dans la régénération, la différenciation de tissu, le contrôle de taille, et le modelage1,7,8.
Au cours de la dernière décennie, de nombreuses études transcriptionnelles sur les tissus régénérants ont permis de mieux comprendre les programmes génétiques sous-jacents à la régénération de la salamandre9,10,11,12,13. Ces études ont ajouté à une liste croissante de gènes candidats qui, à ce jour, sont en grande partie non caractérisés dans le contexte de la régénération. Les techniques ciblées de mutagénèse, telles que CRISPR/Cas, permettent maintenant l’étude de tels gènes, et de telles approches génétiques sont grandement facilitées par le séquençage et l’assemblage récents du grand génome d’axolotl14,15,16.
Nous avons cherché à développer des techniques qui associait la biologie du développement classique à une nouvelle technologie génétique dans le but de disséquer les mécanismes de régénération. Des méthodes pour produire des embryons d’axolotls et d’autres salamandres sont établies depuis des décennies17. Bien que ces techniques aient longtemps été considérées comme des avantages des salamandres en tant qu’organismes modèles génétiques18, peu d’études génétiques ultérieures ont incorporé des animaux haploïdes. Nous utilisons l’activation in vitro dans l’axolotl pour produire des embryons haploïdes qui servent de donneurs de tissus pour la greffe19. À l’aide d’embryons porteurs de marqueurs génétiques fluorescents, nous avons mis au point des méthodes fiables pour générer des membres provenant presque entièrement de tissus donneurs (figure 1A). En combinant ces deux techniques, nous avons contourné la létalité embryonnaire tardive associée à l’héloïdie, permettant la production de membres haploïdes entièrement développés et greffés(figure 1B, Figure 1B’, et Figure 2).
En menant la mutagénèse CRISPR/Cas-négociée dans les embryons haploïdes avant la greffe pour créer des axolotls chimériques avec des membres haploïdes mutants, nous pouvons étudier la fonction de gène spécifiquement dans le contexte du développement et de la régénération de membre. Cela permet de sauver les membres de phénotypes mutants potentiellement embryonnaires-létaux. Tandis que la microinjection de CRISPR/Cas peut produire des animaux qui sont fortement mutants, de tels animaux sont typiquement fortement mosaïque, avec un certain degré de conservation des alloues sauvages de type et une série de mutations distinctes aux emplacements visés14,20. La mutagénèse basée sur CRISPR dans les cellules haploïdes augmente la pénétration des mutations de perte de fonction d’allèle simple, car elles ne peuvent pas être masquées par les allèles de type sauvage retenus. Pour cette raison, le dépistage à base de CRISPR dans les lignées de cellules haploïdes est de plus en plus utilisé pour étudier la base génétique de nombreux processus cellulaires21,22,23. En combinant la lignée à base de CRISPR traçant avec nos protocoles de greffe de bourgeons de membres haploïdes, l’approche décrite ici peut servir de plate-forme pour les écrans génétiques haploïdes chez les animaux vivants20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il y a quelques étapes critiques dans notre protocole pour produire des chimères haploïdes-diploïdes que le technicien d’opération devrait considérer pour des résultats cohérents de greffe.
La raison la plus probable de l’échec de la génération d’haploïdes est due à de mauvaises conditions d’activation in vitro. Les quantités appropriées de sperme motile doivent être utilisées pour activer les œufs. Pour prolonger la motilité, les échantillons de sperme doivent toujours êt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Katherine Roberts pour son soin de la colonie d’axolotl. Le financement de ces travaux a été fourni par le Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 et 15-RMB-YALE-01) et le Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individual Postdoctoral Bourse F32HD086942).
Materials
| #55 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11295-1 | Only use Dumostar material (can be autoclaved) |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | 20 mL |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400 (polysucrose 400) | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1914-250MG | |
| Heating/Cooling Incubator | RevSci | RS-IF-233 | |
| Human Chorionic Gonadotropin | Merk | Chorulon | |
| Megascript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher | AM1334 | 40 reactions |
| Miroscope Cooling Stage | Brook Industries | Custom | Custom |
| NLS Cas9 Protein | PNAbio | CP01-200 | 4 vials of 50 µg protein each |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | Treatment level |
| Recipes | |||
| 1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) | 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4 | ||
| 40% Holtfreter's solution | 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4 |
References
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
- McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).
- Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
- Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
- de Both, N. J. Transplantation of Axolotl Heads. Science. 162 (3852), 460-461 (1968).
- Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
- Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
- Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
- Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352 (2013).
- Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
- Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548 (2018).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
- Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
- Malacinski, G. M., Brothers, A. J. Mutant Genes in the Mexican Axolotl. Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).
- Armstrong, B. Gynogenesis in the mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
- Shalem, O., et al. Genome – scale CRISPR – Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
- Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
- Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Kumar, A., Simon, A. . Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , (2015).
- Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
- Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).
- Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
- Fei, J. -. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).
