Transkripsiyon Faktörlerinin Zorunlu İfadesi Ile İnsan Fibroblastlarının Hemojenik Yeniden Programlanması

Bu protokol Lund Üniversitesi’nin insan araştırma etik komitesi yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir ve bireysel kurumsal yönergelere uygun olarak yapılmalıdır. 1. Reaktif Hazırlama Dulbecco’nun modifiye Eagle’s medium (DMEM)/ fetal sığır serumu (FBS) için sodyum pirüuvat içeren yüksek glikozlu DMEM FBS, %1 penisilin-streptomisin (kalem/strep), %1 L-glutamin, %1 esansiyel olmayan amino asitler ve 10-4-M 2- mercaptoethanol. Komple DMEM için sodyum pirüuvat içeren yüksek glikozlu DMEM ‘i FBS, %1 Kalem/strep ve %1 L-glutamin ile karıştırın. Hematopoetik ortam için hematopoetik ortamı(Malzeme Tablosu)ile 10-6 M hidrokortizon ve %1 kalem/strep ile karıştırın. Kalsiyum veya magnezyum olmadan fosfat tamponlu salin (PBS) kullanın. 2. İnsan Dermal Fibroblast İzolasyon NOT: HDF’ler sertifikalı tedarikçilerden(Malzeme Tablosu)satın alınabilir. Bu durumda, fibroblastları genişletin ve doğrudan yeniden programlama deneylerinde kullanın (bölüm 4). Alternatif olarak, HDF’ler bağışçılardan izole edilebilir. Fibroblastlar farklı donörlerden izole edilmişse, protokolün her adımında numuneleri birbirinden ayrı tutun. Her donörün kimlik numarası ile etiket plakaları/kuyuları ve toplama tüpleri. Uzman hekimler tarafından yapılan 3 mm yuvarlak deri yumruk biyopsilerinden HDF elde edin. 500 μL %0,1 jelatin ve 37 °C’de 20 dakika kuluçka ya da kuluçka ya da 37 °C’de kuluçkaya yatan, doku kültürü yle tedavi edilen 6 kuyuluk üç kuyuyu kaplayın. Kalan jelatin çözeltisini aspire edin ve her kuyuya 750 μL DMEM/ FBS ekleyin. Kuyunun tüm yüzeyi orta ile kaplı olmalıdır. Steril 100 mm petri kabı kapağının iç yüzeyine 1,5 mL DMEM/ FBS ekleyin ve 5 mL serolojik pipet yardımıyla damlayı yayın. Sterilize forceps ile kapak üzerinde orta cilt biyopsisi yerleştirin. Deri biyopsisini dokuz özdeş bölüme ayırın, biyopsiyi yerinde tutmak için sterilize edilmiş neşter ve kesilmesi gereken ikinci bir neşter kullanarak. Sivri uçlu ponponlar kullanarak her kuyuya üç biyopsi parçası yerleştirin. Parçaların kuyunun dibine iliştirdiğinden emin olun. Parçaların üzerine 22 mm’lik bir kapak kaydırın ve biraz basınç uygulayın. Bir hafta boyunca 37 °C, %5 CO2’deplakayı kuluçkaya yatırın. Hücreleri günlük olarak kontrol edin ve buharlaşan ortamı değiştirmek için her 2 günde bir 200 μL DMEM/20% FBS ekleyin. Bir hafta sonra, 2 mL’ye kadar DMEM/20% FBS ekleyin ve orta ortamı 2−3 günde bir değiştirin. Kuyular konca olduğunda (yaklaşık 4−8 hafta) 1:4 oranında geçiş hücreleri. % 0.1 jelatin kaplı doku kültürü tedavi 6-well plakalar hazırlayın. Kuyulardan birleşme ile aspirasyon ortamı ve 1 mL PBS ile bir kez yıkayın. Steril çalgılarla coverslip’i çıkarın ve kapak kapağını doku tarafı yukarı olan 6 kuyuluk yeni bir kuyuya yerleştirin.NOT: Kapak kaymasına bağlı kalan hücreler de hasat edilecektir. Kuyu başına 500 μL ayrışma çözeltisi(Malzeme Tablosu)ekleyin (kapaklı kuyular dahil) ve 37 °C’de kuluçkaya yatırın, 5−10 dk için %5 CO2. her kuyuya 500 μL DMEM/ FBS ek. 15 mL konik tüp içine tüm kuyulardan fibroblastlar toplayın. Kalan hücreleri toplamak için kuyulara ekstra orta ekleyin. 5 dk için 350 x g tüp santrifüj. Bu arada, daha önce jelatin kaplı plakaların her kuyuya 500 μL DMEM/ FBS ekleyin. 6 mL DMEM/ FBS’de aspire orta ve resuspend fibroblastlar. Her kuyuya 500 μL fibroblast süspansiyon ekleyin (numune/donör başına toplam iki adet 6 kuyulu plaka). 37 °C, %5 CO2’debir gecede inkübasyon hücreleri . Ertesi gün, her kuyuya 1 mL DMEM/ FBS ekleyin. Kuyular konakıcı olana kadar orta ortamı 2 mL DMEM/20% FBS ile 2−3 günde bir değiştirin. Üçüncü bölüme ulaşılına kadar üç confluent kuyu için bölüm 2.11’i tekrarlayın. Konfluent kuyulardan fibroblastları dondurun (pasajlar 1 ve 3). Kuyulardan aspirasyon ortamı ve 1 mL PBS ile bir kez yıkayın. 2.11.4 ve 2.11.5 adımlarında açıklandığı gibi fibroblastları ayırın ve toplayın. Bir hemositometre ile hücreleri saymak ve 5 dakika için 350 x g tüp santrifüj. Santrifüj den sonra FBS’de 5 x 105 hücre/mL yoğunlukta DMSO ile aspirasyon orta sı ve resuspend fibroblastlar. Cryovial başına hücre süspansiyon1 mL ekleyin ve dondurucu bir kap kullanarak -80 °C gecede hücreleri dondurma. Uzun süreli depolama için şişeleri -150 °C’ye (sıvı nitrojen) taşıyın. 3. Lentiviral Üretim HEK293T hücrelerini 100 mm doku kültürü yle işlenmiş tam DMEM 10 mL’lik birçanakta, 37 °C,%5 CO 2’de, biraraya ulaşınana kadar yetiştirin. Transfeksiyondan önceki gün, orta aspirasyon ve 5 mL PBS ile yemeği dikkatlice yıkayın. PBS’i çıkardıktan sonra, hücreleri yemekten çıkarmak için 1,5 mL ayrışma çözeltisi ekleyin ve 37 °C’de %5 CO2, 5−10 dk için %5 CO 2’ye inkübül.NOT: Kullanmadan önce hem PBS hem de ayrışma çözeltisini ısıtmak için önerilir, böylece hücreler termal şoka uğramaz. 3 mL tam DMEM ile dissosilasyon çözeltisini inaktive edin ve hücre süspansiyonunu 15 mL konik tüpe aktarın. Kalan bağlı hücreleri çıkarmak için 5 mL tam DMEM ile bulaşıkyıyıyı yıkayın ve bu hacmi 15 mL konik tüpe aktarın. Santrifüj hücre süspansiyonu 350 x g 5 dk. Aspire süpernatant ve çanak başına tam DMEM 10 mL son hacminde altı 100 mm doku kültürü tedavi yemekleri arasında eşit hücre pelet bölünmüş. Hücreler transfeksiyon zamanına kadar yaklaşık oranında konfluent olmalıdır. Ertesi gün, plazmid karışımları ile transfect hücreleri aşağıdaki gibi:NOT: Protokolün bu bölümünde plazmid karışımı başına 100 mm doku kültürü ile tedavi edilen bir çanak içinde lentivirüslerin üretimi açıklanmaktadır. Konsantrasyon için daha yüksek hacimlerde lentiviral supernatant elde etmek için karışım başına en az dört adet 100 mm HEK293T hücre kültürü yemeği kullanın. 15 mL konik bir tüpte, üç transfer plazmidinin 10 μg’sini birlikte ekleyin: 3,33 μg pFUW-tetO-GATA2 (Addgene plazmid #125028)14, 3,33 μg pFUW-tetO-GFI1B (Addgene #125597)14 ve 3,33 μg pFUW-tetO-FOS (Addgene) (Add #125598gene14) 10 μg2 nesil psPAX2 ambalaj vektörü Gagkodlama , Pol, Tat ve Rev genleri (Addgene #12260) ve pMD2.G zarf vektör vsv-G gen kodlama 5 μg (Addgene #12259). 500 μL’ye kadar su ekleyin. İki yeni 15 mL konik tüpler de 10 μg FUW-M2rtTA plazmid (Addgene #20342)17, 10 g psPAX2 ambalaj vektörü ve 5 g pMD2.G zarf vektörü her tüpe ekleyin. 500 μL’ye kadar su ekleyin. Bir tüp kontrol olarak kullanılacak. Her tüp için 2 M CaCl262,5 μL ekleyin. Daha sonra, bir pipet denetleyicisi içine yerleştirilen bir Pasteur pipet kullanarak her karışımiçine kabarcıklar bırakın. Kabarcıklar oluşurken, pipet 500 μL N,N-bis(2-hidroksitil)-2-aminoetanesülfonik asit (BES) tamponlu salin (pH 7.1, 25 °C), P1000 pipet ile, Pasteur pipet karşı damla ve karışım üzerine. En az 15 dakika oda sıcaklığında tüpler inkübasyon. Karışımları bir süre sonra biraz bulutlu görünecektir. Bu arada, HEK293T hücre yemeklerinden aspire ortamı (bir gün önce pasajlı) ve antibiyotiksiz tam DMEM 10 mL ekleyin. Dikkatli olun ve HEK293T hücreleri yarı yapışık olduğu için orta yavaş yavaş ekleyin. Her bir karışımı (yaklaşık 1 mL) eşit ve damla akıllıca ayrı yemeklere dağıtın ve bir gecede 37 °C, %5 CO2’dekuluçkaya yatırın. Orta yı 4 mL tam DMEM, kuluçkadan 24 saat sonra değiştirin. Bir gecede 37 °C,% 5 CO2kuluçka . Varsa, 32 °C, %5 CO2’dekuluçkaya yatırın, çünkü azalan sıcaklık lentiviral partiküllerin yarı ömrünü uzatır. 50 mL konik tüp için üç kez lentiviral parçacıklar ile supernatant toplamak. Bu noktada farklı lentiviral parçacıkları karıştırmayın. Her çanak lentiviral supernatant 12 mL neden olacaktır. Aynı viral preparatdört tabak bir 50 mL konik tüp sığar.DİkKAT: Lentiviral iş için özel bir laminar akış kaputunda biyogüvenlik seviyesi-2 laboratuarında lentiviral toplama gerçekleştirin ve biyolojik tehlikeli maddeler için uygun bir kapta viral kontamine atık (tüpler, ipuçları, yemekler) yerleştirin. Son kuluçkadan sonra ilk koleksiyonu 16 saat yapın ve 4 mL tam DMEM ekleyin. 37 °C,% 5 CO2inkübat. İkinci koleksiyonu aynı tüpe ilk indikten 8 saat sonra yapın, 4 mL tam DMEM ekleyin ve 37 °C,%5 CO2’dekuluçkaya yatırın. Aynı tüp için ikinci sonra üçüncü toplama 16 saat yapın ve bulaşıkları atın.NOT: Her koleksiyondan sonra lentiviral supernatants’ı 4 °C’de saklayın. Her lentiviral supernatant’ı 0,45 m düşük proteinli bağlama filtresi ile selüloz asetat membranı(Malzeme Tablosu)ile temiz bir tüpe süzün. Rejenere selüloz membranı(Malzeme Tablosu)bulunan bir santrifüj filtre ünitesine maksimum 15 mL filtrelenmiş süpernatant ekleyin ve 4 °C’de 25 dakika boyunca 4.000 x g’da döndürün. Akış tan atın. Lentivirüsler içeren viskoz bir sıvı filtre ünitesinde kalır. Daha fazla lentiviral supernatant kalana kadar, filtre ünitesinin üstüne 15 mL supernatant ekleyerek adım 3.13 tekrarlayın.NOT: Konsantre olmak için süpernatant sadece birkaç mililitre olduğunda, 10 dakika iplik süresini azaltmak. Filtrede hala ekstra sıvı (viskoz olmayan) varsa, ek bir 10 dakika santrifüj. Her bir konsantre lentivirüs türünün aliquots (50−200 μL) yapmak ve uzun süreli depolama için -80 °C ‘de (1−2 yıl) veya 4 °C’de kısa süreli depolama için (1−2 hafta) saklayın.NOT: Konsantre veya konsantre olmayan lentivirüsler de taze kullanılabilir. Bu azaltılmış titre ile sonuçlanır gibi yeniden dondurma ve çözülme etmeyin. 4. Hemojenik Yeniden Programlama NOT: Yeniden programlama denemeleri gerçekleştirmek için üç (P3) veya daha yüksek (P10’a kadar) geçiş sayısına sahip HDF’ler kullanın. 100 mm doku kültürü yle işlenmiş bir yemeği %0,1 jelatin 5 mL ve 37 °C’de 20 dk. Kalan jelatin çözeltisini aspire edin. % 0.1 jelatin kaplı çanak bir fibroblast şişe ve plaka hücreleri çözülme. Bir gecede 37 °C,% 5 CO2kuluçka . Gerekirse, istenilen geçit ve kesişme ulaşılana kadar daha uzun bir süre için fibroblastlar genişletin. Coat 6-iyi doku kültürü tedavi plaka ile 500 μL 0.1% jelatin çözeltisi ve kuluçka 37 °C 20 dk. Ekstra jelatin çıkarın. Plaka HDF’leri, her kuyuda 2 mL tam DMEM’de plaka başına 150.000 hücre (kuyu başına 25.000 hücre) yoğunluğunda dır. Hücre eki sağlamak için 37 °C, %5 CO2’degece boyunca kuluçkaya yatırın. Orta ortamı 2 mL tam DMEM artı 8 g/mL polibrene değiştirin. Yeni bir mikrosantrifüj tüp havuz üretilen TF lentiviruses ve M2rtTA bir 1:1 oran karışımı hazırlayın.NOT: Bu protokolde, üç TF için lentiviruses havuz üretimi gerçekleştirilir, hangi, yazarların elinde, daha yüksek yeniden programlama verimliliği ile sonuçlanır. Alternatif olarak, standart bir hücre hattı üzerinde qPCR18tarafından bireysel lentiviral parçacıkların bir titrasyon gerçekleştirmek için önerilmektedir. Bu, eş-transdüksiyon ve hemojenik yeniden programlama için en uygun enfeksiyon (MOI) çokluğunu karşılamak için gerekli olan tek tek virüslerin hacmini tanımlamak için kullanılacaktır. HDF’leri dağıtmak için kuyu başına 10 ila 100 μL mercek karışımı dağıtın. Bu gün -2 yeniden programlama.NOT: Hücre canlılığından ödün vermeden verimli yeniden programlama için lentiviral karışımın en uygun hacminin tanımlanması en iyi duruma getirilmesi gerektirir (daha fazla ayrıntı için Ek Şekil 1’e bakınız). 7’den fazla geçişi olan HDF’ler, daha düşük geçişli hücrelere göre daha yüksek virüs hacimleri gerektirebilir. Kuluçka 16 saat sonra, virüsleri kaldırmak ve tam DMEM ekleyin. Hücrelerin 6−8 saat boyunca toparlanmasına izin verin. İyileştikten sonra orta aspire edin ve 8 g/mL polibrene sahip 2 mL tam DMEM ekleyin. Adım 4.6’da açıklandığı gibi ikinci bir transdüksiyon yapın ve 37 °C’de kuluçkaya yatırın, 16 saat için %5 CO2. Bu gün -1 yeniden programlama. Lentiviral karışım her iki transdüksiyon için -2 gün hazırlanabilir ve 4 °C’de tutulabilir. Ertesi gün, virüsleri çıkarın ve 1 μg/mL DOX ile takviye tam DMEM ekleyin. Bu yeniden programlama gün 0. 37 °C’de kuluçka, 48 saat için %5 CO2. Yeniden programlamanın 2. 1 mL PBS ile aspire ortamı ve yıkama hücreleri. PBS’yi aspire edin ve 500 μL ayrışma çözeltisi ile hücreleri ayırın. Kuluçka 5−10 dk 37 °C, %5 CO2. 1 mL tam DMEM ile dissosilasyon çözeltisini inaktive edin ve hücreleri konik bir tüpe toplayın. Santrifüj 350 x g 5 dk. Peletin hematopoetik ortamda yeniden askıya alınması (bkz. adım 1.3), 1 μg/mL DOX ile desteklenmiş, ve plaka hücreleri yeni doku kültürü yle tedavi edilmiş 6-iyi plakalara % 0,1 jelatin le kaplanmış ve kuyu başına 2 mL’lik son bir hacimde. Yeniden programlama kültürleri (25 gün) süresince haftada iki kez orta (hematopoetik ortam artı DOX) değiştirin. Brightfield veya floresan mikroskobu ile farklı zaman noktalarında yeniden programlanan hücreleri analiz etmek (Bkz. Ek Şekil 2),akış sitometrisi, dökme ve tek hücreli RNA dizilimi ve transplantasyon tahlilleri hematopoetik morfolojisi, endotel ve hematopoetik belirteçlerin varlığı, endotel/hematopoetik gen ekspresyonu profili ve rejenerasyon kapasitesi14. 5. Hemojenik Reprogramming Başlangıcında ChIP-seq Analizi için Fibroblast Genişlemesinin Optimizasyonu Plaka 300.000 HDFs (<P8) 0.1% jelatin kaplı doku kültürü tedavi 6-iyi plakalar tam DMEM ile kuyu başına 2 mL son hacmi. Bir gecede 37 °C,% 5 CO2kuluçka . Ertesi gün orta ortamı 8 g/mL polibren ile tamamlanmış tam DMEM ile değiştirin. Hücreleri tek tek faktörlerle aktarın: pFUW-tetO-FOS14, pLV-tetO-HA-GFI1B (Addgene #125599)14 ve pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2 (Addgene #125600)14 veya üç faktörden oluşan bir havuz, artı FUW-M2rtTA 1:1 oranında. 10−20 μL toplam virüs (bireysel TF + M2rtTA veya üç TFs + M2rtTA) kullanın. 37 °C, %5 CO2’debir gecede inkübasyon hücreleri .NOT: Her koşulda on iki adet 6-iyi plaka kullanılması tavsiye edilir (her tf ve üç TF kombine için). Lentivirüsleri çıkarın ve ilk transdüksiyondan sonra tam DMEM 16 saat ekleyin. Hücrelerin 6−8 saat boyunca iyileşmesine izin verin. Hücreleri ikinci kez aynı miktarda virüs le koşul başına ve 37 °C,% 5 CO2’dekuluçkaya yatırın. Ertesi gün virüsleri kaldırın ve tam DMEM ekleyin. 37 °C’de kuluçka, 24 saat için %5 CO2. Her kuyuyu %0,1 jelatin kaplı doku kültürü yle işlenmiş 100 mm’lik bir tabağa tam DMEM ile çanak başına 10 mL’lik son bir hacme yeniden plakalayın. Bu yaklaşık 1:6 geçişi temsil eder. Hücrelerin 37 °C, %5 CO2’de6 gün boyunca büyümesine izin verin. Gün 6 yeniden kaplama sonra, aspire orta ve 1 μg/mL DOX ile tam DMEM ekleyin. 37 °C’de, %5 CO2’de 2 gün boyunca kuluçkaya yatırın. Fibroblastlar toplamak ve üç TFs genomik bağlama siteleri ayrı ayrı veya birlikte transduced analiz, ChIP-seq tarafından 2 gün DOX takviyesi sonra14.NOT: Son yetmiş iki 100 mm çanak 20−50 x 106 hücreleri arasında, ChIP-seq deneyleri ve çoğaltmayapmak için yeterli içerecektir.