Reprogrammation hémogénique des fibroblastes humains par expression forcée des facteurs de transcription

Ce protocole a été exécuté conformément aux lignes directrices du comité d’éthique de la recherche humaine de l’Université de Lund et devrait être fait conformément aux lignes directrices institutionnelles individuelles. 1. Préparation de réactif Pour le milieu d’aigle modifié (DMEM) modifié de Dulbecco (DMEM)/20% sérum bovin foetal (FBS), mélangez le DMEM à haute teneur en glucose contenant du pyruvate de sodium avec 20% de FBS, 1% pénicilline-streptomycine (pen/strep), 1% L-glutamine, 1% d’acides aminés non essentiels et 10-4-M 2- Mercaptoéthanol. Pour le DMEM complet, mélangez le DMEM à haute teneur en glucose contenant du pyruvate de sodium avec 10 % de FBS, 1 % de stylo/streptocoque et 1 % de L-glutamine. Pour le milieu hématopoïétique, mélanger le milieu hématopoïétique(tableau des matériaux) avec 10-6 M d’hydrocortisone et 1% de stylo/streptocoque. Utilisez de la saline tamponnée en phosphate (PBS) sans calcium ni magnésium. 2. Isolement de fibroblaste dermique humain REMARQUE: Les HDF peuvent être achetés auprès de fournisseurs certifiés(Tableau des matériaux). Dans ce cas, dissiez les fibroblastes et utilisez-les directement dans les expériences de reprogrammation (section 4). Alternativement, les HDF peuvent être isolés des donateurs. Si les fibroblastes sont isolés de différents donneurs, gardez les échantillons séparés les uns des autres à toutes les étapes du protocole. Étiquette des plaques/puits et des tubes de collecte avec le numéro d’identification de chaque donneur. Obtenir des HDF à partir de biopsies rondes de poinçon de peau de 3 mm effectuées par des médecins qualifiés. Enrober trois puits d’une plaque de 6 puits traitée par la culture des tissus avec 500 l de gélatine de 0,1 % et incuber pendant 20 min à 37 oC. Aspirez la solution de gélatine restante et ajoutez 750 L de DMEM/20% FBS à chaque puits. Toute la surface du puits doit être recouverte de milieu. Ajouter 1,5 ml de DMEM/20% FBS à la surface intérieure d’un couvercle stérile de 100 mm de pétri et étaler la goutte à l’aide d’une pipette sérologique de 5 ml. Placer la biopsie de la peau dans le milieu sur le couvercle avec des forceps stérilisés. Disséquer la biopsie de la peau en neuf sections identiques, en utilisant un scalpel stérilisé pour maintenir la biopsie en place et un deuxième scalpel à couper. Placer trois morceaux de biopsie par puits à l’aide de forceps pointus. Assurez-vous que les pièces se fixent au fond du puits. Déposer un couvercle de 22 mm sur le dessus des morceaux et appliquer un peu de pression. Incuber la plaque à 37 oC, 5 % de CO2,pendant une semaine. Vérifier les cellules tous les jours et ajouter 200 L de DMEM/20% FBS tous les 2 jours pour remplacer le milieu évaporé. Après une semaine, ajouter jusqu’à 2 ml de DMEM/20% FBS et remplacer le milieu tous les 2/3 jours. Cellules de passage à un rapport de 1:4 lorsque les puits sont confluents (environ 4 à 8 semaines). Préparer 0,1 % de gélatine enduite de plaques de 6 puits traitées par la culture des tissus. Aspirer le milieu des puits à 80% de consistance et laver une fois avec 1 ml de PBS. Enlever la feuille de couverture avec des forceps stériles et placer la couverture dans un nouveau puits d’une plaque de 6 puits, avec le côté tissulaire vers le haut.REMARQUE: Les cellules qui sont restées attachées à la couverture seront également récoltées. Ajouter 500 l de solution de dissociation (Tableau des matériaux) par puits (y compris les puits avec les couvercles) et incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pendant 5 à 10 min. Vérifier quand les cellules commencent à s’élever du fond du puits et à inactiver la solution de dissociation en l’ajout de 500 L de DMEM/20% FBS à chaque puits. Recueillir les fibroblastes de tous les puits dans un tube conique de 15 ml. Ajouter un milieu supplémentaire aux puits pour recueillir les cellules restantes. Centrifuger le tube à 350 x g pendant 5 min. Entre-temps, ajouter 500 L de DMEM/20% FBS à chaque puits de plaques enduites de gélatine. Aspirer le milieu et resuspendre des fibroblastes dans 6 ml de DMEM/20% FBS. Ajouter 500 ll de suspension de fibroblaste à chaque puits (deux plaques de 6 puits par échantillon/donneur au total). Incuber les cellules pendant la nuit à 37 oC, 5 % de CO2. Le lendemain, ajouter 1 mL de DMEM/20% FBS à chaque puits. Remplacer le milieu par 2 ml de DMEM/20% DE FBS tous les 2/3 jours jusqu’à ce que les puits soient confluents à 80%. Répétez la section 2.11 pour trois puits de confluents jusqu’à ce que le troisième passage soit atteint. Congeler les fibroblastes des puits de confluents (passages 1 et 3). Aspirer le milieu des puits et laver une fois avec 1 ml de PBS. Dissocier et recueillir des fibroblastes tels que décrits dans les étapes 2.11.4 et 2.11.5. Compter les cellules avec un hémocytomètre et centrifuger le tube à 350 x g pendant 5 min. Après centrifugation, aspirez le milieu et resuspendez des fibroblastes dans FBS avec 10% de DMSO à une densité de 5 x 105 cellules/mL. Ajouter 1 ml de suspension cellulaire par cryovial et congeler les cellules pendant la nuit à -80 oC à l’aide d’un contenant de congélation. Déplacer les flacons à -150 oC (azote liquide) pour le stockage à long terme. 3. Production lentivirale Cultivez des cellules HEK293T dans un plat traité par culture tissulaire de 100 mm avec 10 ml de DMEM complet, à 37 oC, 5 % de CO2,jusqu’à ce que la confluence soit atteinte. Le jour précédant la transfection, aspirez à mi-mesure et lavez soigneusement le plat avec 5 ml de PBS. Après avoir enlevé le PBS, ajouter 1,5 mL de solution de dissociation et incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pendant 5 à 10 min pour dissocier les cellules du plat.REMARQUE: Il est recommandé de réchauffer à la fois le PBS et la solution de dissociation avant de l’utiliser, afin que les cellules ne subissent pas de choc thermique. Inactiver la solution de dissociation avec 3 mL de DMEM complet et transférer la suspension cellulaire à un tube conique de 15 ml. Laver le plat avec 5 ml de DMEM complet pour enlever les cellules attachées restantes et transférer ce volume dans le tube conique de 15 ml. Suspension de cellule centrifugeuse à 350 x g pendant 5 min. Aspirez le supernatant et divisez uniformément le granule cellulaire entre six plats traités par culture tissulaire de 100 mm dans un volume final de 10 ml de DMEM complet par plat. Les cellules doivent être environ 60% confluents au moment de la transfection. Le lendemain, les cellules transfect avec le plasmide se mélangecommesuit :REMARQUE : Cette partie du protocole décrit la production des lentivirus dans un plat de culture de tissu de 100 mm par mélange de plasmide. Pour obtenir des volumes plus élevés de supernatant lentiviral pour la concentration, utilisez au moins quatre plats de culture cellulaire HEK293T de 100 mm par mélange. Dans un tube conique de 15 ml, ajouter 10 g des trois plasmides de transfert ensemble : 3,33 g de pFUW-tetO-GATA2 (Addgene plasmid #125028)14, 3,33 g de pFUW-tetO-GFI1B (Addgene #125597)14 et 3,33 g de pFUW-tetO-FOS (Addgene #125598)14plus 10 g du vecteur d’emballage psPAX2 de 2nd de génération codant les gènes Gag, Pol, Tat et Rev (Addgene #12260) et 5 g de vecteur d’enveloppe pMD2.G codant le gène VSV-G (Addgene #12259). Ajouter de l’eau jusqu’à 500 l. Dans deux nouveaux tubes coniques de 15 ml, ajoutez 10 g de plasmide FUW-M2rtTA (Addgene #20342)17, 10 g de vecteur d’emballage psPAX2 et 5 g de vecteur d’enveloppe de pMD2.G à chaque tube. Ajouter de l’eau jusqu’à 500 l. Un tube va être utilisé comme un contrôle. À chaque tube ajouter 62,5 ‘L de 2 M CaCl2. Ensuite, relâchez des bulles dans chaque mélange à l’aide d’une pipet Pasteur insérée dans un contrôleur de pipet. Pendant que des bulles se forment, pipette 500 ‘L de N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acide (BES) tamponné saline (pH 7,1, 25 oC), avec une pipette P1000, goutte-sage contre la pipet Pasteur et sur le mélange. Incuber les tubes à température ambiante pendant au moins 15 min. Les mélanges apparaîtront légèrement nuageux après un certain temps. Pendant ce temps, aspirer à partir de la vaisselle cellulaire HEK293T (passage la veille) et ajouter 10 ml de DMEM complet sans antibiotiques. Soyez prudent et ajoutez moyen lentement car les cellules HEK293T sont semi-adhérentes. Distribuer chaque mélange individuel (environ 1 ml) uniformément et déposer dans des plats séparés et incuber toute la nuit à 37 oC, 5 % CO2. Remplacer le milieu par 4 ml de DMEM complet, 24 h après l’incubation. Incuber toute la nuit à 37 oC, 5 % de CO2. Si disponible, incuber à la place à 32 oC, 5% CO2, car la température réduite augmentera la demi-vie des particules lentivirales. Recueillir le supernatant avec des particules lentivirales trois fois à un tube conique de 50 ml. Ne mélangez pas différentes particules lentivirales à ce stade. Chaque plat se traduira par 12 ml de supernatant lentiviral. Quatre plats de la même préparation virale s’insèrent dans un tube conique de 50 ml.CAUTION : Effectuez la collecte de lentilles dans un laboratoire de niveau 2 de biosécurité dans une hotte à débit laminaire dédiée au travail lentiviral et placez les déchets contaminés viraux (tubes, pointes, vaisselle) dans un contenant approprié pour les matières biodangereuses. Faites la première collecte 16 h après la dernière incubation et ajoutez 4 ml de DMEM complet. Incuber à 37 oC, 5 % DE CO2. Faire la deuxième collecte 8 h après la première au même tube, ajouter 4 ml de DMEM complet et incuber à 37 oC, 5% CO2. Faire la troisième collection 16 h après la seconde au même tube et jeter la vaisselle.REMARQUE: Conserver les supernatants lentiviraux à 4 oC après chaque collecte. Filtrer chaque supernatant lentiviral à l’aide d’un filtre de liaison à faible teneur en protéines de 0,45 m avec une membrane d’acétate de cellulose (Tableau des matériaux) à un tube propre. Ajouter un maximum de 15 ml de supernatant filtré à une unité de filtre centrifuge avec une membrane de cellulose régénérée(tableau des matériaux)et tourner à 4 000 x g pendant 25 min, à 4 oC. Jeter le flux à travers. Un liquide visqueux contenant des lentivirus restera dans l’unité de filtration. Répétez l’étape 3.13 en ajoutant 15 ml de supernatant sur le dessus de l’unité de filtre, jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de supernatant lentiviral à gauche.REMARQUE: Quand il n’y a que quelques millilitres de supernatant pour se concentrer, diminuer le temps de rotation à 10 min. S’il y a encore du liquide supplémentaire (non visqueux) sur le filtre, centrifugeuser pendant 10 min supplémentaires. Faire des aliquots (50 à 200 l selon le volume initial de supernatant) de chaque type de lentivirus concentrés et stocker à -80 oC pour le stockage à long terme (1 à 2 ans) ou à 4 oC pour le stockage à court terme (1 à 2 semaines).REMARQUE: Les lentivirus concentrés ou non concentrés peuvent également être utilisés frais. Ne pas recongeler et décongeler car cela entraîne une réduction de la titer. 4. Reprogrammation hémogène REMARQUE: Utilisez hDFs avec un nombre de passage de trois (P3) ou plus (jusqu’à P10) pour effectuer des expériences de reprogrammation. Enrober un plat traité par culture tissulaire de 100 mm de 5 ml de gélatine de 0,1 % et incuber à 37 oC pendant 20 min. Aspirez la solution de gélatine restante. Décongeler une fiole de fibroblaste et des cellules de plaque dans le plat enrobé de gélatine de 0,1 %. Incuber toute la nuit à 37 oC, 5 % de CO2. Si nécessaire, dilater les fibroblastes pendant une plus longue période jusqu’à ce que le passage et la confluence souhaités soient atteints. Enrober une plaque traitée à la culture de 6 puits de tissus avec 500 l de solution de gélatine de 0,1 % et couver à 37 oC pendant 20 min. Enlever la gélatine supplémentaire. Plaques HDF à une densité de 150.000 cellules par plaque (25.000 cellules par puits) dans 2 ml de DMEM complet par puits. Incuber toute la nuit à 37 oC, 5 % de CO2,pour permettre l’attachement cellulaire. Remplacer le milieu par 2 ml de DMEM complet plus 8 polybrenes de g/mL. Préparer un mélange de ratio 1:1 de lentivirus TF produits en piscine et de M2rtTA dans un nouveau tube de microcentrifuge.REMARQUE: Dans ce protocole, la production en piscine de lentivirus pour les trois TF est effectuée, ce qui, dans les mains des auteurs, se traduit par une plus grande efficacité de reprogrammation. Alternativement, il est suggéré d’effectuer une titration des particules lentivirales individuelles par qPCR18, sur une ligne cellulaire standard. Ceci sera utilisé pour définir le volume de virus individuels nécessaires pour répondre à une multiplicité d’infection (MOI) optimale pour la co-transduction et la reprogrammation hémogène. Distribuer de 10 à 100 L de mélange lentiviral par puits, pour transduire les HDF. C’est le jour -2 de la reprogrammation.REMARQUE: Définir le volume optimal de mélange de lentiviraux pour une reprogrammation efficace, sans compromettre la viabilité cellulaire, nécessite une optimisation (voir la figure supplémentaire 1 pour plus de détails). Les HDF de plus de 7 passages peuvent nécessiter des volumes plus élevés de virus que les cellules ayant des passages inférieurs. Après 16 h d’incubation, retirez les virus et ajoutez du DMEM complet. Laisser les cellules récupérer pendant 6 à 8 h. Après la récupération, aspirer à mi-mesure et ajouter 2 ml de DMEM complet avec 8 polybrenes g/mL. Faites une deuxième transduction telle que décrite à l’étape 4.6 et incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pendant 16 h. C’est le jour -1 de la reprogrammation. Le mélange lentiviral peut être préparé le jour -2 pour les deux transductions et conservé à 4 oC. Le lendemain, retirez les virus et ajoutez du DMEM complet complété par un DOX de 1 g/mL. C’est le jour 0 de la reprogrammation. Incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pour 48 h. Au jour 2 de la reprogrammation, divisez chaque puits à 1:2 ratio. Aspirer les cellules moyennes et laver avec 1 ml de PBS. Aspirez PBS et dissociez les cellules avec 500 L de solution de dissociation. Incuber 5 à 10 min à 37 oC, 5 % DE CO2. Inactiver la solution de dissociation avec 1 ml de DMEM complet et collecter les cellules dans un tube conique. Centrifugeuse à 350 x g pendant 5 min. Resuspendre la pastille dans le milieu hématopoïétique (voir l’étape 1.3), complétée par 1 ‘g/mL DOX, et les cellules de plaque dans de nouvelles plaques de 6 puits traitées par la culture des tissus enduites de 0,1% de gélatine à un volume final de 2 ml par puits. Changer de milieu (moyen hématopoïétique plus DOX) deux fois par semaine pour la durée des cultures de reprogrammation (25 jours). Analyser les cellules reprogrammées résultantes à différents moments par microscopie de champ lumineux ou de fluorescence (voir la figure supplémentaire 2), cytométrie du débit, séquençage de l’ARN en vrac et à cellule unique, et essais de transplantation pour l’acquisition de morphologie hématopoïétique, présence de marqueurs endothéliales et hématopoïétiques, acquisition du profil d’expression génique/hématopoïétique et capacité de régénération14. 5. Optimisation de l’expansion du fibroblaste pour l’analyse ChIP-seq au début de la reprogrammation hémogène Plaque 300 000 HDF (lt;P8) dans 0,1 % de gélatine enduite de plaques de 6 puits traitées par culture de tissus avec un DMEM complet à un volume final de 2 ml par puits. Incuber toute la nuit à 37 oC, 5 % de CO2. Le lendemain, remplacer le milieu par du DMEM complet complété par du polybrene de 8 g/mL. Transduce cellules avec des facteurs individuels: pFUW-tetO-FOS14, pLV-tetO-HA-GFI1B (Addgene #125599)14 et pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2 (Addgene #125600)14 ou avec un pool des trois facteurs, plus FUW-M2rtTA à 1:1 ratio. Utilisez un virus total de 10 à 20 L (TF individuel et M2rtTA ou trois TF et M2rtTA). Incuber les cellules pendant la nuit à 37 oC, 5 % de CO2.REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser douze plaques de 6 puits par condition (pour chaque TF individuel et les trois TF combinés). Enlever les lentivirus et ajouter le DMEM complet 16 h après la première transduction. Laisser les cellules récupérer pendant 6 à 8 h. Transduce les cellules une deuxième fois avec la même quantité de virus par condition et incuber à 37 oC, 5% CO2. Le lendemain, supprimez les virus et ajoutez du DMEM complet. Incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pour 24 h. Re-plaquer chacun bien dans un plat de 100 mm traité par la culture de tissu enduit de 100 mm de gélatine de 0,1 % avec un dMEM complet jusqu’à un volume final de 10 ml par plat. Cela représente environ un passage de 1:6. Laisser les cellules se développer pendant 6 jours à 37 oC, 5 % de CO2. Le jour 6 après le re-plaquage, aspirez à moyen et ajoutez d’un DMEM complet avec 1 DOX de 1 g/mL. Incuber les cellules à 37 oC, 5 % de CO2 pendant 2 jours. Recueillir les fibroblastes et analyser les sites de liaison génomique des trois TF transduisés individuellement ou en combinaison, par ChIP-seq 2 jours après la supplémentation DOX14.REMARQUE: Les 72 derniers plats de 100 mm contiendront entre 20 et 50 x 106 cellules, suffisantes pour effectuer des expériences et des répliques ChIP-seq.