転写因子の強制発現によるヒト線維芽細胞のヘモジェニックリプログラミング

このプロトコルは、ルンド大学の人間研究倫理委員会のガイドラインに従って行われ、個々の制度ガイドラインに従って行われるべきです. 1. 試薬調製 ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)/20%胎児ウシ血清(FBS)の場合、20S、1%ペニシリンストレプトマイシン(ペン/ストレップ)、1%L-グルタミン、1%非必須アミノ酸および10-4-M-2-でピルビン酸ナトリウムを含有する高グルコースDMEMを混合する。メルカプトエタノール。 完全なDMEMの場合は、10S、1%ペン/ストレップ、1%L-グルタミンを含む高グルコースDMEMを混合します。 造血培地の場合は、造血培地(材料表)を10-6Mのヒドロコルチゾンと1%ペン/ストレップと混合します。 カルシウムやマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用してください。 2. ヒト皮膚線維芽細胞分離 注:HDFは、認定サプライヤー(材料表)から購入することができます。その場合は、線維芽細胞を展開し、リプログラミング実験で直接使用します(セクション4)。あるいは、HDFをドナーから分離することもできる。線維芽細胞が異なるドナーから分離されている場合は、プロトコルのすべてのステップでサンプルを互いに分離しておきます。各ドナーの識別番号を持つラベルプレート/井戸と回収チューブ。 資格のある医師が行う3mmラウンドスキンパンチ生検からHDFを取得します。 0.1%ゼラチンの500 μLで組織培養処理された6ウェルプレートの3つのウェルをコーティングし、37°Cで20分間インキュベートする。 残りのゼラチン溶液を吸引し、DMEM/20Sの750 μLを各ウェルに加えます。井戸の全面は媒体で覆われるべきである。 無菌の100mmペトリ皿蓋の内面にDMEM/20Sの1.5 mLを追加し、5 mLの血清学的ピペットの助けを借りてドロップを広げます。 皮膚生検を殺菌鉗子でふたの媒体に入れる。 皮膚生検を9つの同一の切片に解剖し、1つの殺菌されたメスを使用して生検を所定の場所に保持し、2番目のメスを切断する。 尖った鉗子を使用して、井戸ごとに3つの生検片を配置します。井戸の底に取り付ける部分を確認してください。 ピースの上に22ミリメートルのカバースリップを敷き、いくつかの圧力をかけます。 プレートを37°C、5%CO2で1週間インキュベートします。細胞を毎日チェックし、蒸発した媒体を交換するために2日ごとに200 μLのDMEM/20Sを加えます。 1 週間後、DMEM/20% FBS を最大 2 mL 追加し、2 ~3 日ごとにメディアを交換します。 井戸がコンフルエントである場合1:4の比率で通過細胞(約4−8週間)。 0.1%ゼラチンコーティングされた組織培養処理された6ウェルプレートを調製する。 80%のコンフルエンスで井戸から吸引媒体を吸引し、PBSの1 mLで一度洗浄する。 滅菌鉗子でカバースリップを取り外し、カバースリップをティッシュ側を上にして6ウェルプレートの新しい井戸に入れます。注:カバースリップに取り付けられたままのセルも収穫されます。 ウェルあたり解離溶液(材料表)を500μL加え(カバーリップ付きのウェルを含む)、37°Cでインキュベートし、5-10分で5%CO2をインキュベートする。各井戸に500 μLのDMEM/20Sを追加します。 すべての井戸から15 mL円錐形チューブに線維芽細胞を収集します。残りの細胞を収集するために井戸に余分な媒体を追加します。チューブを350 x gで5分間遠心分離します。 その間に、以前にゼラチンコーティングされたプレートの各ウェルに500 μLのDMEM/20Sを加えます。 吸引媒体およびDMEM/20Sの6 mLの線維芽細胞を再中断する。 各ウェルに500μLの線維芽球懸濁液を加えます(サンプル/ドナーあたり6ウェルプレートを合計2枚)。細胞を37°Cで一晩インキュベートし、5%CO2. 翌日、各井戸にDMEM/20Sを1mL加えます。ウェルが80%のコンフルエントになるまで、2~3日ごとに2mLのDMEM/20Sにメディアを交換してください。 3 番目の通路に到達するまで、3 つのコンフルエント ウェルに対してセクション 2.11 を繰り返します。 コンフルエントウェル(通路1および3)から線維芽細胞を凍結する。 ウェルから吸引媒体を吸引し、PBSの1 mLで一度洗浄する。 ステップ2.11.4および2.11.5に記載されているように、関連解解除し、線維芽細胞を収集する。 ヘモサイトメーターで細胞を数え、350 x gでチューブを5分間遠心分離します。 遠心分離後、吸引媒体および5x 105細胞/mLの密度で10%DMSOでFBS中の線維芽細胞を再吸引する。 凍結容器を使用して、凍結毎に細胞懸濁液を1mL加え、-80°Cで一晩細胞を凍結する。バイアルを-150°C(液体窒素)に移動して長期保存します。 3. レンチウイルス生産 完全なDMEMの10 mLで100ミリメートルの組織培養処理皿でHEK293T細胞を成長させ、37°、5%CO2で、コンフルエンスに達するまで。 トランスフェクションの前日に、培地を吸引し、5mLのPBSで丁寧に洗います。 PBSを取り除いた後、解離溶液を1.5mL加え、37°Cでインキュベートし、5~10分間5%CO2で培養し、皿から細胞を解離します。注:細胞が熱ショックを受けないように、使用前にPBSと解離液の両方を温めることをお勧めします。 完全なDMEMの3 mLで解離溶液を不活性化し、細胞懸濁液を15 mL円錐管に移す。完全なDMEMの5 mLで皿を洗い、残りの付着した細胞を取り除き、このボリュームを15 mL円錐管に移します。 遠心分離機細胞懸濁液を350 x gで5分間。 上清を吸引し、6つの100ミリメートルの組織培養処理された皿の間で細胞ペレットを均等に分割し、1皿あたり10mLの最終容積で処理した。細胞は、トランスフェクションの時までに約60%のコンフルエントでなければなりません。 翌日、プラスミドを有するトランスフェクト細胞は以下のように混合する。注:プロトコルのこの部分は、プラスミドミックスあたり1つの100ミリメートルの組織培養処理皿におけるレンチウイルスの産生を記述する。濃縮のためのより多くのレンチウイルス上清を得るために、少なくとも4つの100 mm HEK293T細胞培養皿を1ミックス当たり使用する。 15 mL円錐形チューブに3つの転写プラスミドの10μgを加え#125598pFUW-tetO-GATA2(#125028#125028のアドジーンプラスギド)、3.33μg(アドジーン#125597)、3.33μgのpFUW-teo-teO-14を加えたもの(14#125598 第2世代psPAX2包装ベクターの10μgは、GAG、Pol、TatおよびRev遺伝子(#12260添加)およびVSV-G遺伝子をコードするpMD2.Gエンベロープベクターの5μg(Addgene #12259)をコードする。 500°Lまでの水を加えます。 2つの新しい15 mL円錐チューブに、FUW-M2rtTAプラスミド(アズジーン#20342)17、psPAX2包装ベクターの10μg、pMD2.Gエンベロープベクトルの5μgを各チューブに追加します。500°Lまでの水を加えます。1本のチューブをコントロールとして使用する予定です。 各チューブに2 M CaCl2の62.5 μLを追加します。次に、ピペットコントローラに挿入されたパスツールピペットを使用して、各混合物に気泡を放出します。気泡が形成されている間、ピペット500μLのN,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸(BES)緩衝生理活性酸塩(pH 7.1,25°)を、P1000ピペットと共に、パスツールピペットに対してドロップワイズし、混合物に当てる。 少なくとも15分間室温でチューブをインキュベートする。混合物は、しばらくするとわずかに曇って表示されます。 一方、HEK293T細胞皿から吸引媒体(前日に通過)し、抗生物質なしで完全なDMEMの10 mLを追加する。HEK293T細胞は半密着性を持つため、注意してゆっくりと培地を追加してください。 個々の混合物(約1mL)を均等に分散し、別々の皿に滴下し、37°、5%CO2で一晩インキュベートする。 培地を完全なDMEMの4 mL、インキュベーション後24時間に交換してください。37°で一晩インキュベートし、5%CO2.利用可能な場合は、代わりに32°C、5%CO2でインキュベートし、温度を下げるとレンチウイルス粒子の半減期が増加します。 レンチウイルス粒子で上清を3回集めて50mL円錐管にする。この時点で異なるレンチウイルス粒子を混ぜないでください。各料理はレンチウイルス上清の12 mLをもたらす。同じウイルス製剤の4つの皿は1つの50 mL円錐形の管に合う。注意:レンチウイルスの仕事専用の層流フードでバイオセーフティレベル2の実験室でレンチウイルス収集を行い、ウイルス汚染廃棄物(チューブ、チップ、皿)をバイオ危険物の適切な容器に入れます。 最後のインキュベーションの後に最初のコレクション 16 時間を実行し、完全な DMEM の 4 mL を追加します。37 °C でインキュベート, 5% CO2. 同じチューブに最初の後に2番目のコレクション8 hを行い、完全なDMEMの4 mLを追加し、37°、5%CO2でインキュベートする。 同じチューブに2番目の後に3番目のコレクション16時間を行い、皿を捨てます。注:各収集後4°Cでレンチウイルス上清を保管してください。 0.45μmの低タンパク質結合フィルターを酢酸セルロース膜(材料表)でクリーンチューブに用いて、各レンチウイルス上清を濾過します。 再生セルロース膜(材料表)を備えた遠心フィルターユニットに最大15mLの濾過上清を加え、45分間4,000 x gでスピンします。フロースルーを破棄します。レンチウイルスを含む粘性液体は、フィルターユニットに残ります。 フィルタユニットの上に15mLの上清を加えてステップ3.13を繰り返し、レンチウイルス上清が残らなくなるまで。注:濃縮する上清がわずか数ミリリットルしかない場合は、紡糸時間を10分に減らす。フィルターにまだ余分な液体(非粘性)がある場合は、さらに10分間遠心分離機。 濃縮レンチウイルスの各タイプのアリコート(初期上清量に応じて50~200°L)を作り、長期保存(1~2年)の場合は-80°C、短期保存用は4°C(1~2週間)に保存します。注:濃縮または非濃縮レンチウイルスも新鮮に使用することができる。この結果、小人が減少するので、再凍結して解凍しないでください。 4. ヘモジェニックリプログラミング 注:3つ以上の通過番号(P3)以上(P10まで)のHDFを使用して、リプログラミング実験を実行します。 100mm組織培養処理皿を5mL0.1%ゼラチンでコーティングし、残りのゼラチン溶液を吸引して37°Cでインキュベートします。 0.1%ゼラチンコーティングされた皿の線維芽細胞バイアルとプレート細胞を解凍します。37°で一晩インキュベートし、5%CO2.必要に応じて、所望の通路と合流性に達するまで、線維芽細胞を長期間拡大する。 6ウェル組織培養処理プレートを500μLの0.1%ゼラチン溶液でコーティングし、37°Cで20分間インキュベートします。 プレートごとに 150,000 セル (ウェルあたり 25,000 セル) の密度でプレート HDF を 2 mL のウェルあたりの完全な DMEM で構成します。37°、5%CO2で一晩インキュベートし、細胞付着を可能にする。 中型を完全なDMEM+8μg/mLポリブレンの2 mLに交換してください。新しいマイクロ遠心管にプール生産TFレンチウイルスとM2rtTAの1:1比ミックスを準備します。注:このプロトコルでは、3つのTFに対するレンチウイルスのプール生産が行われ、著者の手では、より高いリプログラミング効率をもたらす。あるいは、qPCR18によって個々のレンチウイルス粒子の滴定を行うことが提案され、標準的な細胞株上で行うことが示唆される。これは、共伝達および血原リプログラミングに最適な感染(MOI)の多重度を満たすために必要な個々のウイルスの量を定義するために使用されます。 ウェルあたり10~100μLのレンチウイルス混合物を配り、HDFをトランスデュースします。これは、リプログラミングの -2 日目です。注:効率的なリプログラミングのためのレンチウイルスミックスの最適なボリュームを定義するには、細胞の生存率を損なうことなく、最適化が必要です(詳細については補足図1を参照)。7 箇所を超える HDF は、より低い通路を持つ細胞よりも大量のウイルスを必要とする可能性があります。 16 時間のインキュベーションの後、ウイルスを除去し、完全な DMEM を追加します。セルが 6 ~8 時間回復できるようにします。 回収後、吸引媒体を加え、8μg/mLポリブレンを用いて完全なDMEMを2mL加えた。 ステップ4.6に記載の2回目の伝達を行い、37°でインキュベートし、16時間5%CO2を行います。これは、リプログラミングの -1 日目です。レンチウイルスミックスは、両方の伝達のために-2日目に調製することができ、4°Cに保つことができます。 翌日、ウイルスを除去し、1 μg/mL DOX を補完する完全な DMEM を追加します。これは、リプログラミングの 0 日目です。37°Cでインキュベートし、48時間5%CO2。 リプログラミングの2日目に、それぞれ1:2の比率でウェルを分割します。 吸引媒体と1mLのPBSで細胞を洗浄する。 500 μL の解離溶液を用いてPBSおよび解離細胞を吸引する。37 °Cで 5−10分、5% CO2をインキュベートする。 完全なDMEMの1 mLで解離溶液を不活性化し、円錐形チューブに細胞を収集します。350 x gで 5 分間遠心分離。 造血培地(ステップ1.3を参照)でペレットを再スマードし、1μg/mL DOXで補充し、0.1%ゼラチンでコーティングされた新しい組織培養処理6ウェルプレートにプレートセルをウェルあたり2mLの最終体積にします。 リプログラミング培養の期間(25日間)に週2回培地(造血培地+DOX)を変更する。 明視野または蛍光顕微鏡(補足図2参照)、フローサイトメトリー、バルクおよび単細胞RNAシーケンシング、および取得のための移植アッセイによって、異なる時点で結果として生じた再プログラムされた細胞を分析する造血形態,内皮および造血マーカーの存在,内皮/造血遺伝子発現プロファイルおよび再生能力14の取得 5. ヘモジェニックリプログラミング発症時のChIP-seq解析のための線維芽細胞拡張の最適化 プレート 300,000 HDF (<P8) 0.1% ゼラチンコーティングされた組織培養処理 6 ウェルプレートで完全な DMEM をウェルあたり 2 mL の最終容積にします。37°で一晩インキュベートし、5%CO2. 翌日、培地を8μg/mLポリブレンを補充した完全なDMEMに交換してください。 個々の因子を有するトランスデュース細胞:pFUW-tetO-FOS 14、pLV-tetO-HA-GFI1B(#125599付き)14およびpFUW-tetO-3xFLAG-GATA2(アドジーン#125600)14または3つの因子のプールを有する、1:1の比率でFUW-M2rtTA。10−20°L合計ウイルス(個々のTF + M2rtTAまたは3つのTF + M2rtTA)を使用します。細胞を37°Cで一晩インキュベートし、5%CO2.注:条件ごとに 12 個の 6 ウェル プレートを使用することをお勧めします (個々の TF と 3 つの TF を組み合わせて使用します)。 レンチウイルスを除去し、最初の導入後に完全なDMEM 16時間を追加します。細胞を6−8時間回復させます。 細胞を状態ごとに同じ量のウイルスで2回目にトランスデュースし、37°、5%CO2でインキュベートする。 翌日にウイルスを削除し、完全なDMEMを追加します。37°Cでインキュベートし、24時間5%CO2。 各ウェルを0.1%ゼラチンコーティングされた組織培養処理100mm皿に、完全なDMEMを1皿あたり10mLの最終容積に再プレートします。これは約1:6の通路を表します。 細胞が37°で6日間増殖することを可能にし、5%CO2. 再めっき後の6日目に、吸引媒体を吸引し、1μg/mL DOXで完全なDMEMを追加します。細胞を37°Cでインキュベートし、5%CO2を2日間行う。 線維芽細胞を収集し、DOX補充14の2日後にChIP-seqによって、個別または組み合わせて誘導された3つのTFのゲノム結合部位を分析する。注:最後の72個の100 mm皿には20-50 x 106セルの間に含まれ、ChIP-seqの実験と複製を行うのに十分です。