Reprogramación hemogénica de fibroblastos humanos por expresión forzada de factores de transcripción

Este protocolo se realizó de acuerdo con las directrices del comité de ética de investigación humana de la Universidad de Lund y debe hacerse de acuerdo con las directrices institucionales individuales. 1. Preparación de reactivos Para el suero bovino fetal (FBS) de Eagle modificado de Dulbecco, mezcle el DMEM de alta glucosa que contiene piruvato sódico con 20% de FBS, 1% penicilina-estreptomicina (penitrina/estreptocina), 1% L-glutamina, 1% aminoácidos no esenciales y 10-4-M 2- Mercaptoetanol. Para DMEM completo, mezcle DMEM de alta glucosa que contenga piruvato sódico con 10% FBS, 1% Pluma/estreptococo y 1% L-glutamina. Para medio hematopoyético, mezcle el medio hematopoyético(Tabla de Materiales)con hidrocortisona de 10-6 M y 1% pluma/estreptococo. Utilice solución salina con fosfato (PBS) sin calcio ni magnesio. 2. Aislamiento de Fibroblastos Dermal Humano NOTA: Los HDF se pueden comprar a proveedores certificados(Tabla de Materiales). En ese caso, expanda los fibroblastos y utilícelos directamente en experimentos de reprogramación (sección 4). Alternativamente, los HDF pueden aislarse de los donantes. Si los fibroblastos están aislados de diferentes donantes, mantenga las muestras separadas entre sí en todos los pasos del protocolo. Etiquetar placas/pozos y tubos de recogida con el número de identificación de cada donante. Obtener HDFs a partir de biopsias redondas de punzonado de la piel de 3 mm realizadas por médicos calificados. Recubrir tres pocillos de una placa de 6 pocillos tratada con cultivo tisular con 500 ml de gelatina al 0,1% e incubar durante 20 min a 37 oC. Aspirar la solución de gelatina restante y añadir 750 s l de DMEM/20% FBS a cada poca. Toda la superficie del pozo debe estar cubierta con medio. Añadir 1,5 ml de DMEM/20% FBS a la superficie interior de una tapa estéril de 100 mm petri para plato y esparcir la gota con la ayuda de una pipeta serológica de 5 ml. Coloque la biopsia de piel en el medio de la tapa con fórceps esterilizados. Diseccionar la biopsia de piel en nueve secciones idénticas, usando un bisturí esterilizado para mantener la biopsia en su lugar y un segundo bisturí para cortar. Coloque tres piezas de biopsia por pozo usando fórceps puntiagudos. Asegúrese de que las piezas se adhieren a la parte inferior del pozo. Poner un cubreobjetos de 22 mm en la parte superior de las piezas y aplicar un poco de presión. Incubar la placa a 37oC, 5% CO2,durante una semana. Compruebe las celdas diariamente y agregue 200 s de DMEM/20% FBS cada 2 días para reemplazar el medio evaporado. Después de una semana, agregue hasta 2 ml de DMEM/20% FBS y reemplace el medio cada 2 x 3 días. Pasar las celdas en proporción 1:4 cuando los pozos son confluentes (alrededor de 4-8 semanas). Preparar 0.1% gelatina recubierta de tejido tratado con 6 placas de 6 pocillos. Aspirar el medio de los pozos al 80% de confluencia y lavar una vez con 1 ml de PBS. Retire el cubreobjetos con fórceps estériles y coloque el cubreobjetos en un nuevo pozo de una placa de 6 pocillos, con el lado del tejido hacia arriba.NOTA: También se cosecharán las células que permanecieron unidas al cubreobjetos. Añadir 500 l de solución de disociación(Tabla de materiales)por pozo (incluidos los pozos con los labios de las cubiertas) e incubar a 37 oC, 5% deCO2 durante 5-10 min. Compruebe cuándo las células comienzan a subir desde la parte inferior del pozo e inactivar la solución de disociación añadiendo 500 sl de DMEM/20% FBS a cada poca. Recoger los fibroblastos de todos los pozos en un tubo cónico de 15 ml. Agregue un medio adicional a los pozos para recoger las celdas restantes. Centrifugar el tubo a 350 x g durante 5 min. Mientras tanto, añada 500 ml de DMEM/20% FBS a cada pozo de placas recubiertas previamente de gelatina. Aspirar medio y resuspender fibroblastos en 6 mL de DMEM/20% FBS. Añadir 500 l de suspensión de fibroblastos a cada pocal (dos placas de 6 pocillos por muestra/donante en total). Incubar células durante la noche a 37oC, 5%CO2. Al día siguiente, agregue 1 mL de DMEM/20% FBS a cada pocto. Reemplace el medio por 2 ml de DMEM/20% FBS cada 2 a 3 días hasta que los pozos sean confluentes al 80%. Repita la sección 2.11 para tres pozos de confluentes hasta que se alcance el tercer pasaje. Congele los fibroblastos de los pozos confluentes (pasajes 1 y 3). Aspirar el medio de los pozos y lavar una vez con 1 mL de PBS. Disociar y recoger fibroblastos como se describe en los pasos 2.11.4 y 2.11.5. Cuente las células con un hemocitómetro y centrifugar el tubo a 350 x g durante 5 min. Después de la centrifugación, aspirar medio y resuspender fibroblastos en FBS con 10% DMSO a una densidad de 5 x 105 células/ml. Añadir 1 ml de la suspensión celular por criovial y congelar las células durante la noche a -80 oC utilizando un recipiente de congelación. Mover los viales a -150 oC (nitrógeno líquido) para su almacenamiento a largo plazo. 3. Producción Lentiviral Cultivar células HEK293T en un plato tratado con cultivo tisular de 100 mm con 10 ml de DMEM completo, a 37 oC, 5% CO2,hasta que se alcance la confluencia. El día anterior a la transfección, aspirar el medio y lavar el plato cuidadosamente con 5 ml de PBS. Después de retirar el PBS, añadir 1,5 ml de solución de disociación e incubar a 37 oC, 5%CO2 durante 5 x 10 min para disociar las células del plato.NOTA: Se recomienda calentar tanto el PBS como la solución de disociación antes de usar, para que las células no sufran un choque térmico. Inactivar la solución de disociación con 3 ml de DMEM completo y transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml. Lave el plato con 5 ml de DMEM completo para eliminar las células adheridas restantes y transferir este volumen al tubo cónico de 15 ml. Suspensión de celda de centrífuga a 350 x g durante 5 min. Aspirar sobrenadante y dividir el pellet celular uniformemente entre seis platos tratados con cultivo de tejido de 100 mm en un volumen final de 10 ml de DMEM completo por plato. Las células deben ser aproximadamente 60% confluentes en el momento de la transfección. Al día siguiente, las células transfect con el plásmido se mezclan de la siguiente manera:NOTA: Esta parte del protocolo describe la producción de lentivirus en un plato tratado con cultivo tisular de 100 mm por mezcla de plásmido. Para obtener mayores volúmenes de sobrenadante lentiviral para la concentración, utilice al menos cuatro platos de cultivo celular HEK293T de 100 mm por mezcla. En un tubo cónico de 15 ml, añadir 10 g de los tres plásmidos de transferencia juntos: 3,33 g de pFUW-tetO-GATA2 (#125028 de Plásmido de Addgene)14, 3,33 g de pFUW-tetO-GFI1B (Addgene #125597)14 y 3,33 g de pFUW-tetO-FOS (Addgene #125598)14 10 g de la2a generación de vectores de embalaje psPAX2 que codifican los genes Gag, Pol, Tat y Rev (Addgene #12260) y 5 g de vector de envolvente pMD2.G que codifica el gen VSV-G (Addgene #12259). Agregue agua de hasta 500 s. En dos nuevos tubos cónicos de 15 ml añaden 10 g de plásmido FUW-M2rtTA (Addgene #20342)17, 10 g de vector de embalaje psPAX2 y 5 g de vector de envolvente pMD2.G a cada tubo. Agregue agua de hasta 500 s. Un tubo va a ser utilizado como un control. A cada tubo añadir 62,5 ml de 2 M CaCl2. A continuación, suelte las burbujas en cada mezcla utilizando un pipeta Pasteur insertado en un controlador de pipetas. Mientras se forman burbujas, pipeta 500 l de N,N-bis(2-hidroxietilo)-2-ácido aminoetanosulfónico (BES) salina tamponada (pH 7.1, 25 oC), con una pipeta P1000, gota contra el pipeta Pasteur y sobre la mezcla. Incubar tubos a temperatura ambiente durante al menos 15 min. Las mezclas aparecerán ligeramente turbias después de algún tiempo. Mientras tanto, aspirar el medio de los platos celulares HEK293T (pasado el día anterior) y añadir 10 ml de DMEM completo sin antibióticos. Tenga cuidado y agregue el medio lentamente ya que las células HEK293T son semiadherentes. Distribuir cada mezcla individual (aproximadamente 1 ml) uniformemente y en la gota en platos separados e incubar durante la noche a 37 oC, 5% CO2. Reemplace el medio por 4 ml de DMEM completo, 24 h después de la incubación. Incubar durante la noche a 37oC, 5% CO2. Si está disponible, incubar en su lugar a 32 oC, 5% CO2, ya que la temperatura reducida aumentará la vida media de las partículas lentivirales. Recoger el sobrenadante con partículas lentivirales tres veces a un tubo cónico de 50 ml. No mezcle diferentes partículas lentivirales en este punto. Cada plato resultará en 12 ml de sobrenadante lentiviral. Cuatro platos de la misma preparación viral encajan en un tubo cónico de 50 ml.ADVERTENCIA: Realizar la recolección lentiviral en un laboratorio de nivel 2 de bioseguridad en una campana de flujo laminar dedicada al trabajo lentiviral y colocar residuos virales contaminados (tubos, puntas, platos) en un recipiente adecuado para materiales biopeligrosos. Haga la primera recolección 16 h después de la última incubación y agregue 4 ml de DMEM completo. Incubar a 37oC, 5% CO2. Hacer la segunda recolección 8 h después de la primera al mismo tubo, añadir 4 mL de DMEM completo e incubar a 37 oC, 5% CO2. Hacer la tercera colección 16 h después de la segunda al mismo tubo y desechar los platos.NOTA: Conservar los sobrenatantes lentivirales a 4oC después de cada colección. Filtrar cada sobrenadante lentiviral utilizando un filtro de unión de proteína baja de 0,45 m con una membrana de acetato de celulosa(Tabla de materiales)a un tubo limpio. Añadir un máximo de 15 ml de sobrenadante filtrado a una unidad de filtro centrífugo con una membrana de celulosa regenerada(Tabla de Materiales)y girar a 4.000 x g durante 25 min, a 4oC. Deseche el flujo. Un líquido viscoso que contenga lentivirus permanecerá en la unidad de filtro. Repita el paso 3.13 añadiendo 15 ml de sobrenadante en la parte superior de la unidad de filtro, hasta que no quede más sobrenadante lentiviral.NOTA: Cuando sólo hay unos pocos mililitros de sobrenadante para concentrarse, disminuir el tiempo de hilado a 10 min. Si todavía hay líquido extra (no viscoso) en el filtro, centrífuga durante 10 minutos adicionales. Hacer alícuotas (50-200 l dependiendo del volumen inicial de sobrenadantes) de cada tipo de lentivirus concentrados y almacenar a -80 oC para almacenamiento a largo plazo (1-2 años) o a 4 oC para almacenamiento a corto plazo (1 x 2 semanas).NOTA: Los lentivirus concentrados o no concentrados también se pueden utilizar frescos. No vuelva a congelar y descongelar, ya que esto reduce el rumbo. 4. Reprogramación hemogénica NOTA: Utilice discos duros con un número de paso de tres (P3) o superior (hasta P10) para realizar experimentos de reprogramación. Recubrir un plato tratado con cultivo tisular de 100 mm con 5 ml de gelatina al 0,1% e incubar a 37 oC durante 20 minutos. Descongelar un vial de fibroblastos y células de placa en el plato recubierto de gelatina 0.1%. Incubar durante la noche a 37oC, 5% CO2. Si es necesario, expanda los fibroblastos durante un período de tiempo más largo hasta que se alcance el paso y la confluencia deseados. Recubrir una placa tratada con cultivo de tejido de 6 pocillos con 500 ml de solución de gelatina al 0,1% e incubar a 37 oC durante 20 min. Retire la gelatina extra. Placa HDFs a una densidad de 150.000 celdas por placa (25.000 celdas por pozo) en 2 ml de DMEM completo por pozo. Incubar durante la noche a 37oC, 5% CO2,para permitir la unión celular. Sustituya el medio por 2 ml de DMEM completo más 8 g/ml de polibreno. Prepare una mezcla de proporción 1:1 de lentivirus TF producidos en la piscina y M2rtTA en un nuevo tubo de microcentrífuga.NOTA: En este protocolo, se realiza la producción de lentivirus para los tres TF, lo que, en manos de los autores, resulta en una mayor eficiencia de reprogramación. Alternativamente, se sugiere realizar una valoración de las partículas lentivirales individuales por qPCR18,en una línea celular estándar. Esto se utilizará para definir el volumen de virus individuales necesarios para satisfacer una multiplicidad de infección (MOI) óptima para la co-transducción y la reprogramación hemogénica. Distribuir de 10 a 100 ml de mezcla lentiviral por pocto, para transducir HDFs. Este es el día -2 de la reprogramación.NOTA: Definir el volumen óptimo de mezcla lentiviral para una reprogramación eficiente, sin comprometer la viabilidad celular, requiere optimización (consulte la Figura Suplementaria 1 para obtener más detalles). Los HDF con más de 7 pasajes pueden requerir mayores volúmenes de virus que las células con pasajes más bajos. Después de 16 h de incubación, eliminar los virus y añadir DMEM completo. Permita que las células se recuperen durante 6 x 8 h. Después de la recuperación, aspirar el medio y añadir 2 mL de DMEM completo con 8 g/ml de polibreno. Realice una segunda transducción como se describe en el paso 4.6 e incubar a 37oC, 5%CO2 durante 16 h. Este es el día -1 de la reprogramación. La mezcla lentiviral se puede preparar el día -2 para las transducciones y mantenerse a 4 oC. Al día siguiente, elimine los virus y agregue el DMEM completo complementado con 1 g/ml DOX. Este es el día 0 de la reprogramación. Incubar a 37oC, 5%CO2 durante 48 h. En el día 2 de la reprogramación, divida cada pozo en proporción 1:2. Aspirar células medianas y de lavado con 1 mL de PBS. Aspirar PBS y disociar células con 500 ml de solución de disociación. Incubar 5 a 10 min a 37oC, 5%CO2. Inactivar la solución de disociación con 1 ml de DMEM completo y recoger las células en un tubo cónico. Centrífuga a 350 x g durante 5 min. Resuspenda el pellet en medio hematopoyético (ver paso 1.3), complementado con DOX de 1 g/ml, y las células de la placa en placas de 6 pocillos tratadas con cultivo de tejido recubiertas con 0,1% de gelatina a un volumen final de 2 ml por pocto. Cambiar medio (medio hematopoyético más DOX) dos veces por semana durante la duración de los cultivos de reprogramación (25 días). Analizar las células reprogramadas resultantes en diferentes puntos de tiempo mediante microscopía de campo brillante o fluorescencia (ver Figura Suplementaria 2),citometría de flujo, secuenciación de ARN a granel y de una sola célula, y ensayos de trasplante para la adquisición de morfología hematopoyética, presencia de marcadores endoteliales y hematopoyéticos, adquisición del perfil de expresión génica endotelial/hematopoyética y capacidad de regeneración14. 5. Optimización de la expansión de fibroblastos para el análisis ChIP-seq al inicio de la reprogramación hemogénica Placa 300.000 HDFs (<P8) en 0.1% placas de 6 pocillos tratadas con cultivo de tejido recubierto de gelatina con DMEM completo a un volumen final de 2 ml por pozo. Incubar durante la noche a 37oC, 5% CO2. Al día siguiente, sustituya el medio por un DMEM completo complementado con polibreno de 8 g/ml. Células transductas con factores individuales: pFUW-tetO-FOS14, pLV-tetO-HA-GFI1B (Addgene #125599)14 y pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2 (Addgene #125600)14 o con un grupo de los tres factores, más FUW-M2rtTA en proporción 1:1. Utilice un virus total de 10 a 20 l (TF + M2rtTA individual o tres TF + M2rtTA). Incubar células durante la noche a 37oC, 5%CO2.NOTA: Se recomienda utilizar doce placas de 6 pocillos por condición (para cada TF individual y los tres TF combinados). Retire los lentivirus y agregue DMEM 16 h completo después de la primera transducción. Deje que las células se recuperen durante 6 x 8 h. Transducir las células por segunda vez con la misma cantidad de virus por condición e incubar a 37 oC, 5%CO2. Al día siguiente, elimine los virus y agregue DMEM completo. Incubar a 37oC, 5%CO2 durante 24 h. Replaca cada pozo en un plato de 100 mm tratado con cultivo de tejido recubierto de gelatina al 0,1% con DMEM completo a un volumen final de 10 ml por plato. Esto representa aproximadamente un pasaje de 1:6. Permitir que las células crezcan durante 6 días a 37oC, 5%CO2. El día 6 después del re-plating, aspirar el medio y añadir DMEM completo con 1 g/ml DOX. Incubar células a 37oC, 5%CO2 durante 2 días. Recoger fibroblastos y analizar los sitios de unión genómica de los tres TF transducidos individualmente o en combinación, por ChIP-seq 2 días después de la suplementación con DOX14.NOTA: Los últimos setenta y dos platos de 100 mm contendrán entre 20 x 50 x 106 células, suficientes para realizar experimentos Y réplicas de ChIP-seq.