Reprogramação hemogénica de fibroblastos humanos pela expressão forçada de fatores de transcrição

Este protocolo foi realizado de acordo com as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana da Universidade de Lund e deve ser feito de acordo com as diretrizes institucionais individuais. 1. Preparação reagente Para o meio modificado da Águia de Dulbecco (DMEM)/20% de soro bovino fetal (FBS), misture o DMEM de alta glicose contendo piruvato de sódio com 20% FBS, 1% penicilina-estreptomicina (caneta/estreptococo), 1% L-glutamina, 1% de aminoácidos não essenciais e 10-4 -M2- mercaptoetanol. Para dmem completo, misture alta glicose DMEM contendo sódio piruvate com 10% FBS, 1% Pen / estreptococos e 1% L-glutamina. Para médio hematopoiético, misture o meio hematopoiético(Tabela de Materiais)com 10-6 M de hidrocortisona e 1% de caneta/estreptococo. Use soro soro para o fosfato (PBS) sem cálcio ou magnésio. 2. Isolamento do fibroblasto dérmico humano Nota: HDFs podem ser comprados de fornecedores certificados(Tabela de Materiais). Nesse caso, expanda os fibroblastos e os use diretamente em experimentos de reprogramação (seção 4). Alternativamente, os HDFs podem ser isolados dos doadores. Se os fibroblastos são isolados de diferentes doadores, manter as amostras separadas uns dos outros em todas as etapas do protocolo. Placas/poços de etiqueta e tubos de coleta com o número de identificação de cada doador. Obter HDFs de 3 mm de biópsias de perfuração de pele redonda realizadas por médicos qualificados. Cubra três poços de uma placa de 6 poços tratada com cultura de tecidocom 500 μL de 0,1% de gelatina e incubada por 20 min a 37 °C. Assaa a solução de gelatina restante e adicione 750 μL de DMEM/20% FBS a cada poço. Toda a superfície do poço deve ser coberta com médio. Adicione 1,5 mL de DMEM/20% FBS à superfície interna de uma tampa estéril de 100 mm da placa de Petri e espalhe a queda com o auxílio de uma pipeta sorológica de 5 mL. Coloque a biópsia da pele no meio na tampa com fórceps esterilizados. Dissecar a biópsia da pele em nove seções idênticas, usando um bisturi esterilizado para manter a biópsia no lugar e um segundo bisturi para cortar. Coloque três peças de biópsia por poço usando fórceps pontiagudos. Certifique-se de que as peças se prendem ao fundo do poço. Coloque um coverslip de 22 mm em cima das peças e aplique alguma pressão. Incubar a placa a 37 °C, 5% CO2, por uma semana. Verifique as células diariamente e adicione 200 μL de DMEM/20% FBS a cada 2 dias para substituir o meio evaporado. Após uma semana, adicione até 2 mL de DMEM/20% FBS e substitua o meio a cada 2 a 3 dias. Células de passagem em 1:4 proporção quando os poços são confluentes (cerca de 4 a 8 semanas). Prepare placas de 6 poços tratadas com cultura de gelatina de 0,1% de gelatina. Aspirate médio de poços em 80% de confluência e lavar uma vez com 1 mL de PBS. Retire o deslizamento de cobertura com fórceps estéreis e coloque o coverslip em um novo poço de uma placa de 6 poços, com o lado do tecido para cima.Nota: As células que permaneceram ligadas ao deslizamento de cobertura também serão colhidas. Adicione 500 μL de solução de dissociação(Tabela de Materiais)por poço (incluindo poços com os lábios) e incubar a 37 °C, 5% CO2 para 5-10 min. Verifique quando as células começam a subir a partir do fundo do poço e inativar a solução de dissociação por adicionando 500 μL de DMEM/20% FBS a cada poço. Coletar fibroblastos de todos os poços em um tubo cônico de 15 mL. Adicione o meio extra aos poços para coletar as células restantes. Centrífuga do tubo a 350 x g por 5 min. Enquanto isso, adicione 500 μL de DMEM/20% FBS a cada poço de placas revestidas de gelatina anteriormente. Aspiro médio e resuspender fibroblastos em 6 mL de DMEM/20% FBS. Adicione 500 μL de suspensão do fibroblasto a cada poço (duas placas de 6 poços por amostra/doador no total). Incubate células durante a noite em 37 °C, 5% CO2. No dia seguinte, adicione 1 mL de DMEM/20% FBS para cada poço. Substitua o meio por 2 mL de DMEM/20% FBS a cada 2 a 3 dias até que os poços sejam 80% confluentes. Repita a seção 2.11 para três poços de confluentes até que a terceira passagem seja alcançada. Congele os fibroblastos dos poços de confluentes (passagens 1 e 3). Aspirate médio dos poços e lavar uma vez com 1 mL de PBS. Dissociar e coletar fibroblastos como descrito nos passos 2.11.4 e 2.11.5. Conte as células com um hemocytometer e centrífuga o tubo a 350 x g por 5 min. Após a centrífugação, aspirar fibroblastos médios e resuspendem na FBS com 10% DMSO a uma densidade de 5 x 105 células/mL. Adicione 1 mL da suspensão celular por criovial e congelar as células durante a noite em -80 °C usando um recipiente de congelamento. Mova frascos para -150 °C (nitrogênio líquido) para armazenamento a longo prazo. 3. Produção lentiviral Crescer células HEK293T em um prato de 100 mm de cultura de tecido tratado com 10 mL de DMEM completo, a 37 °C, 5% CO2, até que a confluência seja alcançada. No dia anterior à transfecção, aspirar médio e lavar o prato cuidadosamente com 5 mL de PBS. Após a remoção da PBS, adicione 1,5 mL de solução de dissociação e incubar a 37 °C, 5% CO2 para 5-10 min para dissociar as células do prato.Nota: Recomenda-se aquecer a solução pbs e dissociação antes de usar, para que as células não sofram um choque térmico. Inativar a solução de dissociação com 3 mL de DMEM completo e transferir a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL. Lave o prato com 5 mL de DMEM completo para remover as células anexadas restantes e transfira este volume para o tubo cônico de 15 mL. Suspensão celular centrífuga a 350 x g por 5 min. Aspirate supernatant e dividir a pelota celular uniformemente entre seis 100 mm tecido cultura tratadapratos em um volume final de 10 mL de DMEM completo por prato. As células devem ser aproximadamente 60% confluent até o momento da transfecção. No dia seguinte, as células transfect com o plasmídeo se misturam da seguinte forma:NOTA: Esta parte do protocolo descreve a produção de lentivírus em um prato de 100 mm tratados com cultura de tecido por mistura plasmídeo. Para obter maiores volumes de supernatant lentiviral para concentração, use pelo menos quatro pratos de cultura de células HEK293T de 100 mm por mistura. Em um tubo cônico de 15 mL, adicione 10 μg dos três plasmídeos de transferência juntos: 3,33 μg de pFUW-tetO-GATA2 (Addgene plasmid #125028)14, 3,33 μg de pFUW-tetO-GFI1B (Addgene #125597)14 e 3,33 μg de pFUW-tetO-FOS (Addgene #125598) + 14 , mais 14 , mais 14 , mais 14 , mais14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, 4, mais 144, mais 144, mais 144, mais 14, mais 14, mais 144, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14, mais 14,mais 10 μg da 2ª geração psPAX2 embalagem vetores codificando a mordaça, Pol, Tat e rev genes (Addgene #12260) e 5 μg de pMD2.G envelope vetor codificando o gene VSV-G (Addgene #12259). Adicione a água até 500 μL. Em dois novos tubos cônicos de 15 mL adicionam 10 μg de plasmid FUW-M2rtTA (Addgene #20342)17,10 μg de vetor de embalagens psPAX2 e 5 μg de vetor de envelope pMD2.G a cada tubo. Adicione a água até 500 μL. Um tubo vai ser usado como um controle. A cada tubo adicione 62,5 μL de 2 M CaCl2. Em seguida, libere bolhas em cada mistura usando um pipet pasteur inserido em um controlador de tubos. Enquanto as bolhas estão se formando, pipette 500 μL de N,N-bis(2-hidroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic ácido (BES) salina tampão (pH 7,1, 25 °C), com uma pipeta P1000, drop-wise contra o tubo Pasteur e sobre a mistura. Incubam tubos à temperatura ambiente por pelo menos 15 min. As misturas aparecerão ligeiramente nebuloso depois de algum tempo. Enquanto isso, aspirar médio de pratos de células HEK293T (passado no dia anterior) e adicionar 10 mL de DMEM completo sem antibióticos. Tenha cuidado e adicione o meio lentamente como células HEK293T são semi-aderentes. Distribua cada mistura individual (aproximadamente 1 mL) uniformemente e drop-wise em pratos separados e incubar durante a noite em 37 °C, 5% CO2. Substitua o meio por 4 mL de DMEM completo, 24 h após a incubação. Incubar durante a noite em 37 °C, 5% CO2. Se disponível, incubar em vez de 32 °C, 5% CO2, como a temperatura reduzida irá aumentar a meia-vida das partículas lentivirais. Colete supernatant com partículas lentivirais três vezes a um tubo cónico de 50 mL. Não misture diferentes partículas lentivirais neste momento. Cada prato resultará em 12 mL de supernatant lentiviral. Quatro pratos da mesma preparação viral cabem em um tubo cônico de 50 mL.CUIDADO: Realize a coleta lentiviral em um laboratório de nível 2 de biossegurança em um capô de fluxo laminar dedicado ao trabalho lentiviral e coloque resíduos contaminados virais (tubos, dicas, pratos) em um recipiente apropriado para materiais bioperigosos. Faça a primeira coleção 16 h após a última incubação e adicione 4 mL de DMEM completo. Incubar a 37 °C, 5% CO2. Faça a segunda coleção 8 h após o primeiro para o mesmo tubo, adicione 4 mL de DMEM completo e incubar a 37 °C, 5% CO2. Faça a terceira coleção 16 h após o segundo para o mesmo tubo e descartar os pratos.Nota: Armazenar supernatantes lentivirais a 4 °C após cada coleção. Filtre cada supernatant lentiviral usando um filtro de ligação de 0,45 μm de baixa proteína com uma membrana de acetato de celulose(Tabela de Materiais)para um tubo limpo. Adicione um máximo de 15 mL de supernatant filtrado a uma unidade centrífuga do filtro com uma membrana regenerada da celulose(tabela dos materiais)e gire em 4.000 x g para 25 min, em 4 °C. Descarte o fluxo. Um líquido viscoso contendo lentivírus permanecerá na unidade de filtro. Repita o passo 3.13 adicionando 15 mL de supernatant em cima da unidade de filtro, até que não haja mais supernatant lentiviral esquerda.Nota: Quando há apenas alguns mililitros de supernatant para se concentrar, diminuir o tempo de fiação para 10 min. Se ainda houver líquido extra (não viscoso) no filtro, centrífuga por mais 10 min. Faça alíquotas (50 a 200 μL dependendo do volume supernatant inicial) de cada tipo de lentivírus concentrados e guarde a -80 °C para armazenamento a longo prazo (1-2 anos) ou em 4 °C para armazenamento a curto prazo (1-2 semanas).Nota: Lentivírus concentrados ou não concentrados também podem ser usados frescos. Não recongele e descongele, pois isso resulta em redução do díter. 4. Reprogramação hemogénica Nota: Use HDFs com um número de passagem de três (P3) ou superior (até P10) para realizar experimentos de reprogramação. Cubra um prato de 100 mm tratado sitecido com 5 mL de 0,1% de gelatina e incubada a 37 °C por 20 min. Aspirate a solução de gelatina restante. Descongele um frasco de fibroblasto e células de placa no prato revestido de gelatina de 0,1%. Incubar durante a noite em 37 °C, 5% CO2. Se necessário, expanda fibroblastos por um período de tempo mais longo até que a passagem e a confluência desejadas estejam alcançadas. Cubra uma placa de 6 poços tratadas com cultura de tecido com 500 μL de 0,1% de solução de gelatina e incubar a 37 °C por 20 min. Retire gelatina extra. HDFs de placa a uma densidade de 150.000 células por placa (25.000 células por poço) em 2 mL de DMEM completo por poço. Incubar durante a noite em 37 °C, 5% CO2, para permitir o acessório celular. Substitua o meio por 2 mL de DMEM completo mais 8 μg/mL polibrene. Prepare uma mistura de proporção de 1:1 de lentivírus TF produzidos em piscina e M2rtTA em um novo tubo de microcentrífuga.Nota: Neste protocolo, é realizada a produção de pool de lentivírus para os três TFs, o que, nas mãos dos autores, resulta em maior eficiência de reprogramação. Alternativamente, sugere-se realizar uma titration das partículas lentivirais individuais por qPCR18,em uma linha de pilha padrão. Isso será usado para definir o volume de vírus individuais necessários para atender a uma multiplicidade de infecção (MOI) ideal para co-transdução e reprogramação hemogénica. Distribua 10 a 100 μL de mistura lentiviral por poço, para transduzir HDFs. Este é o dia -2 de reprogramação.Nota: Definir o volume ideal de mix lentiviral para reprogramação eficiente, sem comprometer a viabilidade celular, requer otimização (ver Figura Suplementar 1 para mais detalhes). HDFs com mais de 7 passagens podem exigir maiores volumes de vírus do que as células com passagens mais baixas. Após 16 h de incubação, remover vírus e adicionar DMEM completo. Permita que as células se recuperem por 6 a 8 h. Após a recuperação, aspirar médio e adicionar 2 mL de DMEM completo com 8 μg/mL polibrene. Faça uma segunda transdução, conforme descrito na etapa 4.6 e incubar a 37 °C, 5% CO2 para 16 h. Este é o dia -1 de reprogramação. A mistura lentiviral pode ser preparada no dia -2 para ambas as transducações e mantida em 4 °C. No dia seguinte, retire os vírus e adicione o DMEM completo complementado com 1 μg/mL DOX. Este é o dia 0 de reprogramação. Incubar a 37 °C, 5% CO2 para 48 h. No dia 2 de reprogramação, dividir cada poço em 1:2 relação. Aspirate células médias e lavam com 1 mL de PBS. Aspirate PBS e dissociar células com 500 μL de solução de dissociação. Incubar 5-10 min a 37 °C, 5% CO2. Inativar a solução de dissociação com 1 mL de DMEM completo e coletar células em um tubo cônico. Centrífuga a 350 x g por 5 min. Resuspenda a pelota no meio hematopoiético (ver passo 1.3), complementada com 1 μg/mL DOX, e células de placa em novas placas de 6 poços tratadas pela cultura de tecidores com gelatina de 0,1% a um volume final de 2 mL por poço. Alterar médio (médio hematopoiético mais DOX) duas vezes por semana para a duração das culturas de reprogramação (25 dias). Analise as células reprogramadas resultantes em diferentes momentos por microscopia de campo brilhante ou fluorescência (ver Figura Suplementar 2),citometria de fluxo, sequenciamento de RNA em massa e células únicas e ensaios de transplante para a aquisição de morfologia hematopoiética, presença de marcadores endotélicos e hematopoiéticos, aquisição do perfil de expressão gênica endoteliética/hematopoiética e capacidade de regeneração14. 5. Otimização da expansão do fibroblasto para análise de ChIP-seq no início da reprogramação hemogenic Placa 300.000 HDFs (<P8) em 0,1% de espuma revestida de tecido de 6 poços tratados com DMEM completo para um volume final de 2 mL por poço. Incubar durante a noite em 37 °C, 5% CO2. No dia seguinte, substitua o meio por DMEM completo complementado por polibreno de 8 μg/mL. Células transduciantes com fatores individuais: pFUW-tetO-FOS14, pLV-tetO-HA-GFI1B (Addgene #125599)14 e pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2 (Addgene #125600)14 ou com um pool dos três fatores, além de FUW-M2rtTA às 1:1 ratio. Use 10 a 20 μL vírus total (TF individual + M2rtTA ou três TFs + M2rtTA). Incubate células durante a noite em 37 °C, 5% CO2.Nota: Recomenda-se usar doze placas de 6 poços por condição (para cada TF individual e os três TFs combinados). Remover lentivírus e adicionar DMEM completo 16 h após a primeira transdução. Deixe as células se recuperarem por 6 a 8 h. Transduzem as células uma segunda vez com a mesma quantidade de vírus por condição e incubam a 37 °C, 5% CO2. No dia seguinte, remover vírus e adicionar DMEM completo. Incubar a 37 °C, 5% CO2 para 24 h. Replacar cada poço em um prato de 100 mm tratado sigelatina de 0,1% com DMEM completo para um volume final de 10 mL por prato. Isso representa aproximadamente uma passagem de 1:6. Permitir que as células cresçam por 6 dias a 37 °C, 5% DECO 2. No dia 6 após o re-revestimento, aspirar médio e adicionar DMEM completo com 1 μg/mL DOX. Incubate células a 37 °C, 5% CO2 por 2 dias. Coletar fibroblastos e analisar locais de ligação genômica dos três TFs transduzidos individualmente ou em combinação, por ChIP-seq 2 dias após a suplementação DOX14.Nota: Os pratos finais de setenta e dois 100 mm conterão entre 20 a 50 x 106 células, suficientes para realizar experimentos e réplicas de ChIP-seq.