Riprogrammazione emogenica dei fibroblasti umani mediante l'espressione forzata dei fattori di trascrizione

Questo protocollo è stato eseguito secondo le linee guida del comitato etico della ricerca umana dell’Università di Lund e dovrebbe essere fatto in conformità con le singole linee guida istituzionali. 1. Preparazione del reagente Per il siero bovino bovino fetale (FBS) modificato da Dulbecco, miscelare il DMEM ad alto glucosio contenente pirava di sodio con il 20% di FBS, l’1% di penicillina-streptomicina (pen/streptomici), l’1% di l-glutamine, il 1% di acidi non essenziali di amminom e 10-4 -2-M- Mercaptoetanolo. Per il DMEM completo, mescolare il DMEM ad alto glucosio contenente piravate di sodio con 10% FBS, 1% Penna/strepe e 1% L-glutamina. Per il mezzo ematopoietico, mescolare il mezzo ematopoietico (Tabella dei materiali) con 10-6 M idrocortisone e 1% penna/strep. Utilizzare la salina tampone fosfato (PBS) senza calcio o magnesio. 2. Isolamento del fibroblasto dermico umano NOT:</ Gli HDF possono essere acquistati presso fornitori certificati (Table of Materials). In tal caso, espandere i fibroblasti e utilizzarli direttamente negli esperimenti di riprogrammazione (sezione 4). In alternativa, gli HDF possono essere isolati dai donatori. Se i fibroblasti sono isolati da donatori diversi, tenere i campioni separati l’uno dall’altro in tutte le fasi del protocollo. Etichettare piastre/pozzi e tubi di raccolta con il numero di identificazione di ciascun donatore. Ottenere HDF da biopsie punzone pelle rotonda da 3 mm eseguite da medici qualificati. Cappotto tre pozze di una piastra di 6 pozze di tessuto trattata con 500 L di 0,1% di gelatina e incubare per 20 min a 37 gradi centigradi. Aspirati la soluzione di gelatina rimanente e aggiungete 750 -L di DMEM/20% di FBS ad ogni pozzo. L’intera superficie del pozzo deve essere coperta con il mezzo. Aggiungere 1,5 mL di DMEM/20% FBS alla superficie interna di un coperchio sterile da 100 mm per parabola di Petri e stendere la goccia con l’aiuto di una pipetta sierologica da 5 mL. Posizionare la biopsia cutanea nel mezzo sul coperchio con pinze sterilizzate. Sezionare la biopsia cutanea in nove sezioni identiche, utilizzando un bisturi sterilizzato per tenere la biopsia in posizione e un secondo bisturi da tagliare. Posizionare tre pezzi di biopsia per pozzo utilizzando pinze appuntite. Assicurarsi che i pezzi si attacchino alla parte inferiore del pozzo. Posare un coperchio da 22 mm sopra i pezzi e applicare un po ‘di pressione. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi, 5% CO2, per una settimana. Controllare le cellule ogni giorno e aggiungere 200 L di DMEM/20% FBS ogni 2 giorni per sostituire il mezzo evaporato. Dopo una settimana, aggiungere fino a 2 mL di DMEM/20% FBS e sostituire medio ogni 2/3 giorni. Celle di passaggio a rapporto 1:4 quando i pozzi sono confluenti (circa 4-8 settimane). Preparare lo 0,1% di tessuto rivestito di gelatina trattati con 6 pozze di acqua. Mezzo aspirato da pozzi all’80% di confluenza e lavare una volta con 1 mL di PBS. Rimuovere il coperchio con pinze sterili e posizionare il coperchio in un nuovo pozzo di una piastra di 6 pozzetti, con il lato del tessuto verso l’alto. NOT:</ Saranno raccolte anche le cellule rimaste attaccate al coperchio. Aggiungere 500 l di soluzione di dissociazione (Tabella dei materiali) per pozzo (compresi i pozzetti con i coprilabbra) e incubare a 37 c, 5% CO2 per 5-10 min. Controllare quando le cellule iniziano a salire dal fondo del pozzo e inattivare la soluzione di dissociazione aggiungendo 500 L di DMEM/20% FBS ad ogni pozzo. Raccogliere i fibroblasti da tutti i pozzi in un tubo conico da 15 mL. Aggiungere un mezzo extra ai pozzetto per raccogliere le cellule rimanenti. Centrifugare il tubo a 350 x g per 5 min. Nel frattempo, aggiungere 500 L di DMEM/20% FBS ad ogni pozzo di piatti precedentemente rivestiti di gelatina. Aspirati media e resuspend fibroblasts in 6 mL di DMEM/20% FBS. Aggiungere 500 l di sospensione del fibroblasto ad ogni pozzo (due piastre 6-pozze per campione/donatore in totale). Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi centigradi, 5% DI CO2. Il giorno successivo, aggiungere 1 mL di DMEM/20% FBS a ogni pozzo. Sostituire il supporto con 2 mL di DMEM/20% FBS ogni 2/3 giorni fino a quando i pozzi sono confluenti dell’80%. Ripetere la sezione 2.11 per tre pozzi confluenti fino al raggiungito terzo passaggio. Congelare i fibroblasti dai pozzi confluenti (passaggi 1 e 3). Aspirare mezzo dai pozzi e lavare una volta con 1 mL di PBS. Dissociare e raccogliere i fibroblasti come descritto nei passaggi 2.11.4 e 2.11.5. Contare le cellule con un emocitometro e centrifugare il tubo a 350 x g per 5 min. Dopo la centrifugazione, aspirare mezzo e resuspend fibroblasts in FBS con 10% DMSO ad una densità di 5 x 105 cellule / mL. Aggiungere 1 mL della sospensione cellulare per crioviale e congelare le celle durante la notte a -80 gradi centigradi utilizzando un contenitore di congelamento. Spostare le fiale a -150 gradi centigradi (azoto liquido) per lo stoccaggio a lungo termine. 3. Produzione Lentivirale Coltivare le cellule HEK293T in un piatto di 100 mm trattato con coltura di tessuto con 10 mL di DMEM completo, a 37 c, 5% DI CO2, fino a raggiungere la confluenza. Il giorno prima della trasfezione, aspirare mezzo e lavare il piatto con attenzione con 5 mL di PBS. Dopo aver rimosso PBS, aggiungere 1,5 mL di soluzione di dissociazione e incubare a 37 gradi centigradi, 5% di CO2 per 5/10 min per dissociare le cellule dal piatto. NOT:</ Si raccomanda di riscaldare sia PBS che la soluzione di dissociazione prima dell’uso, in modo che le cellule non subiscano uno shock termico. Inattivare la soluzione di dissociazione con 3 mL di DMEM completo e trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL. Lavare il piatto con 5 mL di DMEM completo per rimuovere le celle rimanenti collegate e trasferire questo volume al tubo conico da 15 mL. Sospensione cellulare centrifuga a 350 x g per 5 min. Aspirato supernatante e dividere il pellet cellulare in modo uniforme tra sei piatti trattati con coltura di tessuti da 100 mm in un volume finale di 10 mL di DMEM completo per piatto. Le cellule devono essere circa il 60% confluenti al momento della trasfezione. Il giorno successivo, le cellule transfett con le miscele di plasmidi come segue:NOTA: Questa parte del protocollo descrive la produzione di lentivirus in un piatto trattato con 100 mm come coltura di tessuto per mix di plasmide. Per ottenere volumi più elevati di supernatali lentivirali per la concentrazione, utilizzare almeno quattro piatti di coltura cellulare HEK293T da 100 mm per mix. In un tubo conico da 15 mL, aggiungere insieme 10 g di tre plasmidi di trasferimento: 3,33 g di pFUW-tetO-GATA2 (Addgene plasmid #125028)14, 3,33 g di pFUW-tetO-GFI1B (Addgene #125597)14 e 3,33 g di pFUW-tetO-FOS (Add #125598gene) 10 g del vettore di imballaggio psPAX2 di 2di nd generazione che codifica i geni Gag, Pol, Tat e Rev (Addgene #12260) e 5 g di vettore di inviluppo pMD2.G che codifica il gene VSV-G (Addgene #12259). Aggiungere acqua fino a 500 l. In due nuovi tubi conici da 15 mL si aggiungono 10 g di plasmide FUW-M2rtTA (Addgene #20342)17, 10 g di vettore di imballaggio psPAX2 e 5 g di vettore di inviluppo pMD2.G ad ogni tubo. Aggiungere acqua fino a 500 l. Un tubo verrà usato come controllo. Ad ogni tubo aggiungere 62,5 gradi di 2 M CaCl2. Successivamente, rilasciare le bolle in ogni miscela utilizzando un pipet Pasteur inserito in un controller pipet. Mentre si stanno formando bolle, pipette 500 – L di N,N-bis(2-idrossitohyl)-2-aminoethanesulfonico acido (BES) bufferato salina (pH 7.1, 25 ) ), con una pipetta P1000, gocciolanti contro il pipet Past e sulla miscela. Incubare i tubi a temperatura ambiente per almeno 15 min. Le miscele appariranno leggermente nuvolose dopo qualche tempo. Nel frattempo, mezzo aspirato da piatti cellulari HEK293T (passato il giorno prima) e aggiungere 10 mL di DMEM completo senza antibiotici. Fare attenzione e aggiungere media lentamente come cellule HEK293T sono semi-aderenti. Distribuire ogni miscela individuale (circa 1 mL) in modo uniforme e drop-saggio in piatti separati e incubare durante la notte a 37 , 5% CO2. Sostituire il supporto con 4 mL di DMEM completo, 24 h dopo l’incubazione. Incubare pernottamento a 37 gradi centigradi, 5% CO2. Se disponibile, incubare invece a 32 gradi centigradi, 5% di CO2, poiché la temperatura ridotta aumenterà l’emivita delle particelle lentivirali. Raccogliere supernatante con particelle lentivirali tre volte in un tubo conico da 50 mL. Non mescolare diverse particelle lentivirali a questo punto. Ogni piatto si tradurrà in 12 mL di supernatante lentivirale. Quattro piatti della stessa preparazione virale si inseriscono in un tubo conico da 50 ml.PRUDENTE: Eseguire la raccolta lentivirale in un laboratorio di biosicurezza livello 2 in una cappa di flusso laminare dedicata al lavoro lentivirale e posizionare i rifiuti contaminati virali (tubi, punte, piatti) in un contenitore appropriato per materiali biopericolosi. Fare la prima collezione 16 h dopo l’ultima incubazione e aggiungere 4 mL di DMEM completo. Incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2. Fate la seconda collezione 8 h dopo la prima allo stesso tubo, aggiungete 4 mL di DMEM completa e incubate a 37 gradi centigradi, 5% CO2. Fate la terza collezione 16 h dopo la seconda allo stesso tubo e scartate i piatti. NOT:</ Conservare i supernatanti lentivirali a 4 gradi centigradi dopo ogni collezione. Filtrare ogni supernatante lentivirale utilizzando un filtro legante a bassa proteina di 0,45 m con una membrana di acetato di cellulosa (Tabella dei materiali) in un tubo pulito. Aggiungere un massimo di 15 mL di supernatante filtrato a un’unità filtrante centrifuga con una membrana di cellulosa rigenerata (Tabella dei materiali) e girare a 4.000 x g per 25 min, a 4 gradi centigradi. Scartare il flow-through. Un liquido viscoso contenente lentivirus rimarrà nell’unità filtro. Ripetere il passaggio 3.13 aggiungendo 15 mL di supernatante sopra l’unità filtro, fino a quando non rimane più supernatante lentivirale. NOT:</ Quando ci sono solo pochi millilitri di supernatante da concentrazione, diminuire il tempo di filatura a 10 min. Se sul filtro è ancora presente un liquido aggiuntivo (non viscoso), centrifugare per altri 10 min. Crea delle aliquote di ogni tipo di lentivirus concentrate e conserva a -80 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine (1o2 anni) o a 4 gradi centigradi per lo stoccaggio a breve termine (1/2 settimane). NOT:</ Anche i lentivirus concentrati o non concentrati possono essere utilizzati freschi. Non ricongelare e scongelare in quanto ciò comporta una riduzione del titro. 4. Riprogrammazione emogenica NOT:</ Utilizzare HDF con un passaggio di tre (P3) o superiore (fino a P10) per eseguire esperimenti di riprogrammazione. Rivestire un piatto di 100 mm trattato con 5 mL di gelatina dello 0,1% e incubare a 37 gradi centigradi per 20 minuti. Aspirate la soluzione di gelatina rimanente. Scongelare una fiala fibroblasta e le cellule della piastra nel piatto rivestito di gelatina dello 0,1%. Incubare pernottamento a 37 gradi centigradi, 5% CO2. Se necessario, espandere i fibroblasti per un periodo di tempo più lungo fino a raggiungere il passaggio e la confluenza desiderati. Rivestire una piastra trattata con una coltura tissutale di 6 pozze con 500 gradi di gelatina dello 0,1% e incubare a 37 gradi centigradi per 20 min. Rimuovere la gelatina supplementare. Appiatti a densità di 150.000 cellule per piastra (25.000 cellule per pozzo) in 2 mL di DMEM completo per pozzo. Incubare peruna durante la notte a 37 gradi centigradi, 5% CO2, per consentire l’attaccamento cellulare. Sostituire il supporto con 2 mL di DMEM completo più 8 g/mL di polibrene. Preparare un mix di rapporto 1:1 di lentivirus TF prodotti in piscina e M2rtTA in un nuovo tubo di microcentrifuga. NOT:</ In questo protocollo, viene eseguita la produzione in pool di lentivirus per le tre TF, che, nelle mani degli autori, si traduce in una maggiore efficienza di riprogrammazione. In alternativa, si suggerisce di eseguire una titolazione delle singole particelle lentivirali da qPCR18, su una linea cellulare standard. Questo sarà utilizzato per definire il volume dei singoli virus necessari per soddisfare una molteplicità di infezione (MOI) ottimale per la co-trasduzione e la riprogrammazione emogenica. Distribuire da 10 a 100 l di miscela lentivirale per pozzo, per traducire gli HDF. Questo è il giorno -2 della riprogrammazione. NOT:</ La definizione del volume ottimale della miscela lentivirale per una riprogrammazione efficiente, senza compromettere la vitalità cellulare, richiede l’ottimizzazione (vedere Figura supplementare 1 per ulteriori dettagli). Gli HDF con più di 7 passaggi possono richiedere volumi di virus più elevati rispetto alle cellule con passaggi inferiori. Dopo 16 h di incubazione, rimuovere i virus e aggiungere DMEM completo. Consentire al ripristino delle celle per 6-8 h. Dopo il recupero, aspirare il mezzo e aggiungere 2 mL di DMEM completo con 8 g/mL di polibrene. Eseguire una seconda trasduzione come descritto al punto 4.6 e incubare a 37 , 5% CO2 per 16 h. Questo è il giorno -1 della riprogrammazione. La miscela lentivirale può essere preparata il giorno -2 per entrambe le trasduzioni e mantenuta a 4 gradi centigradi. Il giorno successivo, rimuovere i virus e aggiungere il DMEM completo integrato con 1 og/mL DOX. Questo è il giorno 0 della riprogrammazione. Incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2 per 48 h. Al giorno 2 della riprogrammazione, dividere ogni pozzo a 1:2 rapporto. Mezzo aspirato e cellule di lavaggio con 1 mL di PBS. Cellule PBS e dissociate aspirata con 500 litri di soluzione di dissociazione. Incubare 5/10 min a 37 gradi centigradi, 5% CO2. Disattivare la soluzione di dissociazione con 1 mL di DMEM completo e raccogliere le cellule in un tubo conico. Centrifuga a 350 x g per 5 min. Risospendere il pellet in mezzo ematopoietico (vedi passo 1.3), integrato con 1 g/mL DOX, e le cellule piatte in nuove lastre di 6 pozzetti trattati con coltura dei tessuti rivestiti con 0,1% di gelatina ad un volume finale di 2 mL per pozzo. Cambiare il mezzo (mezzo ematopoietico più DOX) due volte a settimana per la durata delle culture di riprogrammazione (25 giorni). Analizzare le cellule riprogrammate risultanti in diversi punti temporali mediante microscopia a campo luminoso o a fluorescenza (vedere Figura supplementare 2), citometria di flusso, sequenziamento di massa e RNA unicellulare e analisi dei trapianti per l’acquisizione di morfologia ematopoietica, presenza di marcatori endoteliali ed ematopoietici, acquisizione del profilo di espressione genica endoteliale/ematopoietica e capacità di rigenerazione14. 5. Ottimizzazione dell’espansione fibroblasta per l’analisi ChIP-seq all’inizio della riprogrammazione emogenica Piastra 300.000 HDF (<P8) in 0,1% di tessuto rivestito di gelatina trattati con 6 pozzetti con DMEM completo ad un volume finale di 2 mL per pozzo. Incubare pernottamento a 37 gradi centigradi, 5% CO2. Il giorno successivo, sostituire il supporto con dMEM completo integrato con 8 g/mL di polibrene. Traduci cellule con fattori individuali: pFUW-tetO-FOS14, pLV-tetO-HA-GFI1B (Addgene #125599)14 e pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2 (Addgene #125600)14 o con un pool dei tre fattori, più FUW-M2rtTA a 1:1 rapporto. Utilizzare il virus totale di 10-20 ll (tF individuale – M2rtTA o tre TF – M2rtTA). Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi centigradi, 5% DI CO2. NOT:</ Si consiglia di utilizzare dodici piastre 6-pono per condizione (per ogni singolo TF e le tre TF combinate). Rimuovere i lentivirus e aggiungere il DMEM completo 16 h dopo la prima trasduzione. Lascia che le cellule si riprendano per 6/8 h. Trasduci le cellule una seconda volta con la stessa quantità di virus per condizione e incuba a 37 gradi centigradi, 5% di CO2. Il giorno successivo rimuovere i virus e aggiungere DMEM completo. Incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2 per 24 h. Ri-piastra ogni pozzo in un 0.1% gelatina rivestito tessuto tessuto rivestito 100 mm piatto con DMEM completo ad un volume finale di 10 mL per piatto. Questo rappresenta approssimativamente un passaggio 1:6. Consentire alle cellule di crescere per 6 giorni a 37 , 5% CO2. Il giorno 6 dopo la ri-placcatura, mezzo aspirato e aggiungere dMEM completo con 1 :g/mL DOX. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2 per 2 giorni. Raccogliere i fibroblasti e analizzare i siti di legame genomico dei tre TF trasmessi singolarmente o in combinazione, da ChIP-seq 2 giorni dopo il completamento di DOX14. NOT:</ Gli ultimi settantadue piatti da 100 mm conterranno tra 20-50 x 106 celle, sufficienti per eseguire esperimenti ChIP-seq e repliche.