Гемогенное перепрограммирование фибробластов человека путем принудительного выражения факторов транскрипции

Этот протокол был выполнен в соответствии с руководящими принципами комитета по этике человеческих исследований Лундского университета и должен осуществляться в соответствии с индивидуальными институциональными руководящими принципами. 1. Подготовка реагента Для модифицированного орла Dulbecco (DMEM)/20% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), смешать высокий уровень глюкозы DMEM, содержащий пируват натрия с 20% FBS, 1% пенициллин-стрептомицин (перо/стрепто, 1% L-глутамамин, 1% несущественные аминокислоты и 10-4-M – меркаптоэтанол. Для полного DMEM, смешать высокий уровень глюкозы DMEM, содержащий пируват натрия с 10% FBS, 1% Pen/strep и 1% L-глютамин. Для гематопоитической среды, смешать гематопоиетическую среду (Таблица материалов) с 10-6 M гидрокортизон и 1% пера / стреп. Используйте фосфат-буферный солен (PBS) без кальция или магния. 2. Изоляция дермальных фибробластов человека ПРИМЕЧАНИЕ: HDFs можно приобрести у сертифицированных поставщиков(Таблица материалов). В этом случае расширьте фибробласты и используйте их непосредственно в экспериментах по перепрограммированию (раздел 4). Кроме того, ПГФ могут быть изолированы от доноров. Если фибробласты изолированы от разных доноров, держите образцы отделенными друг от друга на всех этапах протокола. Этикетка пластин / колодцев и трубки сбора с идентификационным номером каждого донора. Получить HDFs от 3 мм круглых биопсий пунша кожи в исполнении квалифицированных врачей. Пальто три колодца ткани культуры обработанных 6-наилучшим образом пластины с 500 л 0,1% желатина и инкубировать в течение 20 мин при 37 градусов по Цельсию. Усиливайте оставшийся желатиновый раствор и добавляйте 750 л DMEM/20% FBS к каждой скважине. Вся поверхность колодца должна быть покрыта средой. Добавьте 1,5 мл DMEM/20% FBS на внутреннюю поверхность стерильной 100 мм крышки чашки Петри и разложите каплю с помощью серологического пипетки калибра 5 мл. Поместите биопсию кожи в среду на крышку со стерилизованные щипты. Расчлените биопсию кожи на девять одинаковых секций, используя один стерилизованный скальпель для проведения биопсии на месте и второй скальпель, чтобы сократить. Поместите три части биопсии на хорошо с помощью остроконечных щипков. Убедитесь, что части прикрепляются к нижней части колодца. Положите 22 мм coverslip на верхней части и применить некоторое давление. Инкубировать тарелку при 37 градусах Цельсия, 5% CO2,в течение недели. Проверяйте клетки ежедневно и добавляйте 200 кЛ DMEM/20% FBS каждые 2 дня, чтобы заменить испаряемую среду. Через неделю добавьте до 2 мл DMEM/20% FBS и замените среду каждые 2-3 дня. Проходные клетки при соотношении 1:4 при слиянии скважин (около 4–8 недель). Приготовьте 0,1% желатина с покрытием ткани культуры обработанных 6-колодец пластин. Аспирная среда из скважин при 80% вспыхивании и мойте один раз с 1 мл PBS. Удалить coverslip с стерильными щипками и поместите coverslip в новый колодец 6-колодец пластины, с тканью вверх.ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, которые остались прикреплены к крышке, также будут собраны. Добавьте 500 зЛ диссоциационизмовательного раствора(Таблица материалов)на скважину (включая скважины с крышками) и инкубируйте при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 в течение 5–10 мин. Проверьте, когда клетки начинают подниматься со дна скважины, и инактивируйте диссоциационный раствор добавив 500 зл DMEM/20% FBS к каждой скважине. Соберите фибробласты из всех скважин в коническую трубку 15 мл. Добавьте дополнительный средний к скважинам, чтобы собрать оставшиеся ячейки. Центрифуга трубки на 350 х г в течение 5 мин. В то же время, добавить 500 зл DMEM/20% FBS к каждой скважине ранее желатина покрытием пластин. Аспирифицируетсредние и повторно приостанавливают фибробласты в 6 мл DMEM/20% FBS. Добавьте 500 зЛ фибробластной суспензии к каждой скважине (две 6-колодцовые пластины на образец/донор в общей сложности). Инкубировать клетки на ночь при 37 градусах Цельсия, 5% CO2. На следующий день, добавить 1 мл DMEM/20% FBS к каждой скважине. Заменяйте среду на 2 мл DMEM/20% FBS каждые 2-3 дня, пока скважины не будут сопливыми. Повторите раздел 2.11 для трех сливочные скважины до тех пор, пока не будет достигнут третий проход. Заморозить фибробласты из сливожих скважин (проходы 1 и 3). Аспирируем средство из скважин и мыть один раз с 1 мл PBS. Диссоциатив и сбор фибробластов, как описано в шагах 2.11.4 и 2.11.5. Подсчитайте клетки с гемоситометром и центрифуги трубку на 350 х г в течение 5 мин. После центрифугирования, аспирировать средние и resuspend фибробластов в FBS с 10% DMSO при плотности 5 х 105 клеток / мл. Добавьте 1 мл клеточной суспензии на криовую и заморозить клетки на ночь при -80 градусов по Цельсию с помощью замораживания контейнера. Перемещай флаконы до -150 градусов по Цельсию (жидкий азот) для длительного хранения. 3. Лентивирное производство Выращивайте клетки HEK293T в культовой тарелке 100 мм с 10 мл полного DMEM, при 37 КС, 5% CO2,до тех пор, пока не будет достигнута нештатная выпуклость. На кануне трансфекции, аспирировать средний и мыть блюдо тщательно с 5 мл PBS. После удаления PBS, добавить 1,5 мл раствора диссоциации и инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 в течение 5-10 минут, чтобы отделить клетки от блюда.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется прогреть как PBS, так и раствор диссоциации перед использованием, чтобы клетки не страдали от теплового шока. Инактивируйте раствор диссоциации с 3 мл полного DMEM и перенесите клеточную подвеску на коническую трубку 15 мл. Вымойте блюдо с 5 мл полного DMEM, чтобы удалить оставшиеся прикрепленные клетки и передать этот объем в 15 мл конической трубки. Суспензия центробежных клеток при 350 х г в течение 5 мин. Аспирный супернатант и равномерно расщепляйте клеточные гранулы между шестью 100-мм культовыми блюдами в окончательном объеме 10 мл полного DMEM на блюдо. Клетки должны быть примерно 60% конфлюентирования к моменту трансфекции. На следующий день трансфектные клетки с плазмидными смесями:ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола описывает производство лентивирусов в одном 100 мм ткани культуры обработанных блюдо на плазмидную смесь. Для получения более высоких объемов лентивирусного супернатанта для концентрации, используйте не менее четырех 100 мм HEK293T клеточной культуры блюд в смеси. В 15 мл конической трубки, добавить 10 мкг из трех плазмидов передачи вместе: 3,33 мкг pFUW-tetO-GATA2 (Addgene плазмид #125028)14, 3,33 мкг pFUW-tetO-GFI1B (Addgene #125597)14 и 3,33 мкг pFUW-te #125598t 10 мкг вектора упаковки2-го поколения psPAX2, кодирующего гены Gag, Pol, Tat и Rev (Addgene #12260) и 5 мкг вектора конверта pMD2.G, кодирующего ген VSV-G (Addgene #12259). Добавьте воду до 500 л. В двух новых 15 мл конических труб добавить 10 мкг FUW-M2rtTA плазмида (Addgene #20342)17, 10 мкг psPAX2 упаковки вектор и 5 мкг pMD2.G конверт вектор для каждой трубки. Добавьте воду до 500 л. Одна трубка будет использоваться в качестве элемента управления. К каждой трубке добавляем 62,5 л 2 M CaCl2. Далее, выпустить пузыри в каждой смеси с помощью пастера вставляется в контроллер пипетки. В то время как пузырьки образуются, пипетка 500 л N,N-bis(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтанесульфоновая кислота (BES) буферный солен (pH 7.1, 25 c), с пипеткой P1000, дроп-мудрым против пайпа Пастера и на смесь. Инкубировать трубки при комнатной температуре не менее 15 мин. Через некоторое время смесятся облачность. Между тем, аспирсредовая среда из heK293T клеточных блюд (проходима накануне) и добавить 10 мл полного DMEM без антибиотиков. Будьте осторожны и добавить среду медленно, как HEK293T клетки полу-придерживаться. Распределите каждую отдельную смесь (примерно 1 мл) равномерно и по-разному на отдельные блюда и инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия, 5% CO2. Замените среду на 4 мл полного DMEM, 24 ч после инкубации. Инкубировать ночь при 37 градусах Цельсия, 5% CO2. При наличии, инкубировать вместо этого при температуре 32 градуса Цельсия, 5% CO2, так как пониженная температура увеличит период полураспада лентивирусных частиц. Соберите супернатант с лентивирусными частицами три раза до 50 мл конической трубки. Не смешивайте различные ленцивиральные частицы в этой точке. Каждое блюдо приведет к 12 мл лентивирусного супернатанта. Четыре блюда одного и того же вирусного приготовления вписываются в одну коническую трубку 50 мл.ВНИМАНИЕ: Выполните лентивирусную коллекцию в лаборатории уровня биобезопасности-2 в ламинарном капюшоне потока, предназначенном для лецивирной работы, и поместите вирусные загрязненные отходы (трубки, советы, посуда) в подходящий контейнер для биоопасных материалов. Сделайте первую коллекцию 16 ч после последней инкубации и добавьте 4 мл полного DMEM. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2. Сделайте вторую коллекцию 8 ч после первого в ту же трубку, добавьте 4 мл полного DMEM и инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2. Сделайте третью коллекцию 16 ч после второй в ту же трубку и отбросить посуду.ПРИМЕЧАНИЕ: Храните лентивирусные супернацианты при 4 градусах По Цельсию после каждой коллекции. Фильтр каждого lentiviral супернатант с помощью 0,45 мкм низкобелковый связывающий фильтр с клеточной ацетатной мембраны (Таблица материалов) в чистую трубку. Добавьте максимум 15 мл фильтровального супернатанта в центробежный фильтрсретельс с регенерированной целлюлозной мембраной(Таблица материалов)и закрутите при 4000 х г в течение 25 мин при 4 градусах Цельсия. Отбросьте поток через. В фильтровальной установке останется вязкая жидкость, содержащая лентивирусы. Повторите шаг 3.13, добавив 15 мл супернатанта в верхней части фильтровального блока, пока не останется больше лентивирусного супернатанта.ПРИМЕЧАНИЕ: Когда есть только несколько миллилитров супернатанта, чтобы сконцентрироваться, уменьшить время вращения до 10 мин. Если на фильтре еще есть дополнительная жидкость (невязкая), центрифуга еще 10 мин. Сделать аликвоты (50–200 л в зависимости от первоначального сверхнатантного объема) каждого типа концентрированных лентивирусов и хранить при уровне -80 градусов по Цельсию для длительного хранения (1–2 года) или при 4 градусах Цельсия для кратковременного хранения (1–2 недели).ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрированные или неконцентрированные лентивирусы также могут быть использованы свежими. Не замораживайте и не замораживайте, так как это приводит к уменьшению титера. 4. Гемогенное перепрограммирование ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте HDFs с номером прохождения три (P3) или выше (до P10) для выполнения экспериментов перепрограммирования. Пальто 100 мм ткани культуры обработанных блюдо с 5 мл 0,1% желатина и инкубировать при 37 кв кв 20 мин. Аспир оставшийся желатин овый раствор. Оттепель фибробластный флакон и пластины клеток в 0,1% желатина покрытием блюдо. Инкубировать ночь при 37 градусах Цельсия, 5% CO2. При необходимости расширьте фибробласты в течение более длительного периода времени до достижения желаемого прохода и стельности. Пальто 6-хорошо ткани культуры обработанных пластины с 500 л 0,1% желатина раствора и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 20 мин. Удалить дополнительный желатин. Плита HDFs при плотности 150000 клеток на пластину (25000 клеток на скважину) в 2 мл полного DMEM на скважину. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия, 5% CO2,чтобы позволить вложению клеток. Замените среду на 2 мл полного DMEM плюс 8 мкг/мл полибрена. Подготовьте смесь соотношения 1:1 из производимых в пуле TF лентивирусов и M2rtTA в новой микроцентрифуговой трубке.ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе выполняется пул-производство лентивирусов для трех TFs, что, по мнению авторов, приводит к более высокой эффективности перепрограммирования. Кроме того, предлагается выполнить титрование отдельных лентивирных частиц qPCR18, на стандартной клеточной линии. Это будет использоваться для определения объема отдельных вирусов, необходимых для удовлетворения множественности инфекции (МВД), оптимальной для котрансдукции и гемогенного перепрограммирования. Распределите от 10 до 100 л/с лентивирусной смеси на скважину, чтобы преобразовать HDF. Это день -2 перепрограммирования.ПРИМЕЧАНИЕ: Определение оптимального объема лентивирусной смеси для эффективного перепрограммирования без ущерба для жизнеспособности клеток требует оптимизации (подробнее см. Дополнительную диаграмму 1). HDFs с более чем 7 проходами может потребовать больших объемов вирусов, чем клетки с более низкими проходами. После 16 ч инкубации, удалить вирусы и добавить полный DMEM. Разрешить клеткам восстанавливаться в течение 6-8 ч. После восстановления, аспир среднего и добавить 2 мл полного DMEM с 8 мкг /мл полибрена. У второй трансдукции, как описано в шаге 4,6 и инкубировать на 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 для 16 ч. Это день -1 перепрограммирования. Лентивирная смесь может быть подготовлена в день -2 для обоих трансдукций и хранится при 4 градусах Цельсия. На следующий день, удалить вирусы и добавить полный DMEM дополнены 1 мкг /мл DOX. Это день 0 перепрограммирования. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 на 48 ч. На второй день перепрограммирования, разделить каждый хорошо на 1:2 соотношение. Аспирируй средние и мыть клетки с 1 мл PBS. Аспирировать PBS и разъединять клетки с 500 злителю диссоциационизмного раствора. Инкубировать 5-10 мин при 37 градусах Цельсия, 5% CO2. Инактивируйте раствор диссоциации 1 мл полного DMEM и соберите клетки в коническую трубку. Центрифуга при 350 х г в течение 5 мин. Приостановите пеллеты в гематопоитической среде (см. шаг 1.3), дополненный 1 мкг/мл DOX, и пластинки в новые ткани культуры обработанных 6-колодных пластин, покрытых 0,1% желатин до окончательного объема 2 мл на скважину. Изменение среды (гематопоиетическая среда плюс DOX) два раза в неделю в течение продолжительности перепрограммирования культур (25 дней). Анализ в результате перепрограммированных клеток в разных точках времени с помощью яркой или флуоресценционной микроскопии (см. Дополнительная рисунок 2), цитометрия потока, массовое и одноклеточное секвенирование РНК, и трансплантационные анализы для приобретения гематопоитической морфологии, наличие эндотелиальных и гематопогетических маркеров, приобретение эндотелиального/гематопойетического профиля экспрессии генов и регенерационной способности14. 5. Оптимизация расширения Фибробластов для анализа CHIP-seq в начале гемогенного перепрограммирования Плита 300,000 HDFs (Злт;P8) в 0,1% желатина покрытием ткани культуры обработанных 6-колодец пластин с полным DMEM до окончательного объема 2 мл на скважину. Инкубировать ночь при 37 градусах Цельсия, 5% CO2. На следующий день замените среду с полным DMEM, дополненным 8 мкг/мл полибрена. Преобразующие клетки с индивидуальными факторами: pFUW-tetO-FOS14,pLV-tetO-HA-GFI1B (Addgene #125599)14 и pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2 (Addgene #125600)14 или с пулом из трех факторов, плюс FUW-M2rtTA в соотношении 1:1. Используйте общий вирус от 10–20 л (индивидуальный TF и M2rtTA или три TFs и M2rtTA). Инкубировать клетки на ночь при 37 градусах Цельсия, 5% CO2.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать двенадцать 6-колодных пластин на одно состояние (для каждого отдельного TF и трех TFs вместе взятых). Удалить лентивирусы и добавить полный DMEM 16 ч после первого трансдукции. Пусть клетки восстанавливаются в течение 6 х8 ч. Преобразуем клетки во второй раз с таким же количеством вируса на одно состояние и инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2. На следующий день удалите вирусы и добавьте полный DMEM. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 на 24 ч. Re-пластины каждый хорошо в 0,1% желатина покрытием ткани культуры обработанных 100 мм блюдо с полным DMEM до окончательного объема 10 мл на блюдо. Это представляет собой примерно 1:6 прохода. Разрешить клеткам расти в течение 6 дней при 37 градусах Цельсия, 5% CO2. На 6-й день после повторного покрытия, аспир среднего и добавить полный DMEM с 1 мкг /мл DOX. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 в течение 2 дней. Соберите фибробласты и проанализируйте геномные места связывания трех TFs, транскорпорированных индивидуально или в комбинации, по ChIP-seq через 2 дня после DOX добавок14.ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные 72 100 мм блюда будут содержать между 20 х 106 клеток, достаточно для выполнения экспериментов ChIP-seq и репликации.